Testes Bioquímicos - Identificação de Bactéria

I. Introdução: Uma forma rotineira de identificação de bactérias são os testes bioquímicos. Os testes bioquímicos usam o conhecimento de reações enzimáticas dos diferentes tipos de microrganismos, podendo assim identificar a espécie presente no meio. Antes de nos aprofundar um pouco mais nos tipos de teste bioquímico e como funcionam, é de suma importância o conhecimento do que é o meio de cultivo. Nesta prática foram realizados os seguintes testes bioquímicos: 1. OF(oxidativo/fermentativo): As bactérias metabolizam carboidratos por oxidação ou fermentação, a diferença entre esses dois processos se deve ao fato de que a oxidação é um processo aeróbio, ou seja, necessita de O2 para que ocorra e a fermentação é anaeróbia, ou seja, ocorre sem a utilização do O2. Para que ocorra a melhor diferenciação desses processos no teste OF, são utilizados dois tubos, um com óleo impedindo o contato do meio com o O2 da atmosfera, e outro sem óleo, permitindo esse contato. 2. Descarboxilação: Este teste tem como objetivo determinar a capacidade de descarboxilação das bactérias em relação a 3 diferentes substancias, Ornitina, Lisina e Arginina. 3. SIM (Sulfeto/Indol/Mobilidade): O meio SIM consiste em 3 testes para a identificação de bactérias: • Produção de H2S (Sulfeto) • Produção de Indol • Mobilidade 4. LIA (Lisina Iron Ágar) O teste LIA é utilizado na identificação de enterobactérias. Esse teste possui peptonas e extrato de leveduras que favorecem o crescimento bacteriano. A fermentação de glicose abaixa o pH e este fica amarelo. Se ocorrer atividade da enzima lisina descarboxilase o pH aumentará, e o meio voltará a apresentar uma coloração roxa. 5. TSI (Triple Sugar Iron) O meio de TSI fornece uma série de reações bioquímicas que dão uma visão geral do metabolismo bacteriano. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido inclinado semeado com agulha por punctura na base e estrias na superfície. Após o crescimento da bactéria é possível observar alguns resultados, como: A bactéria não fermenta qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio. Fermenta somente a glicose de tal sorte que os ácidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinação vermelha. Fermenta a lactose ou a sacarose com mudança do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas. Há também a possibilidade da bactéria analisada produzir H2S, por respirar anaeróbiamente. 6. Citrato O teste é feito semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citratase resulta na formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato há formação de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos. 7. MRVP O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da metabolização da glicose. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6, apesar de ainda ser ácido, como há uma concentração menor de íons de hidrogênio, o indicador muda para amarelo e é uma prova negativa. II. Objetivo Determinar através de testes bioquímicos, qual bactéria estava presente no tubo de ensaio, através das mudanças nos meios de cultura devido a suas funções metabólicas em diferentes situações III. Materiais e Métodos II.A Materiais -Tubos de ensaios; -Bactéria a ser determinada (E. coli); -Bico de Bunsen; -Agulha de transferência e -Meios de cultura. II.B Métodos No início da prática foi diluida uma bacteria desconhecida até a 10-6, com um auxílio de uma pipeta esterelizada, um bico de bunsen e seis tubos. Após este processo pode-se fazer uso desta bactéria para transportar para os tubos onde continham os meios: Prova de Vermelho de Metila (MR), Prova de Voges- Proskauer (VP), Citrato, Meio Agar Lisina Ferro (Lia), Tripla Sugar Iron Agar (TSI), Base sem aminoácido, Lisina, Ornitina, Arigilina, Meio Agar MacConkey (LAC), Glic e SB. Para todos os tubos houve o mesmo procedimento, o qual com o auxílio de uma alça introduziu no tubo o qual continha a bactéria diluida até 10-6, e introduziu nos tubos que continham os meios, após a incubação de sete dias pode-se averiguar os resultados onde no tubo onde continha o meio MR adicionou-se Indol, que é um indicador de coloração avermelhada, para saber se o teste de crescimento de bactéria nesse meio deu certo, com os outros tubos que continha os outros meios fora feita a comparação de antes e depois da incubação de uma semana IV. Resultados

Figura 1: Meio para teste Methyl Red e Voges-Parker.

Figura 2: Representação do resultado positivo para Methyl Red, como obtido neste experimento.

Figura 3: Representação do resultado negativo para Voges-Proskauer, como obtido neste experimento.

Figuras 4 e 5: Ambos os testes de Sorbitol tiveram resultados negativos.

Figura 5 e 6: Ambos os testes de Glicose tiveram resultado positivo.

Figura 7 e 8: Ambos os testes de Lactose tiveram resultado positivo.

Figura 9 e 10: Teste negativo de OF.

Figura 11 e 12: Teste negativo para Lisina.

Figura 13 e 14: Teste negativo para Ornitina.

Figura 15 e 16: Teste negativo para Arginina.

Figura 16:: No teste SIM, o meio ficou totalmente turvo.

Figura 15: Teste negativo para H2S e positivo para formação de gás.

Figura 16: Resultado positivo.

Figura 17: Teste negativo. V. Discussão De acordo com os resultados obtidos, pode-se concluir que a bactéria inoculada foi a Escherichia Coli. Tendo dado positivo, o teste de Methyl Red, essa bactéria é capaz de fazer fermentação mista ácida com glicose, gerando um pH menor que 4,5. Isso porque, ao colocar o vermelho de metila, observou-se a formação de um arco rosa na parte superior do meio. O teste de Voges-Prosker indicou que a bactéria produz acetoína, após o término do teste, era a mesma. De acordo com o teste SIM, essa bactéria é móvel pois só se reproduziu além da região em que a agulha foi inserida. É possível ver que ela se reproduziu dessa forma pois o meio se apresenta totalmente turvo. A produção de Indol foi negada pelo mesmo teste, pois não houve uma transformação da cor do meio para vermelho. Assim como a produção de sulfeto, pois não se observa formação de precipitado negro. O meio de Lisina Iron Agar se tornou roxo, demonstrando que a bactéria possui uma enzima chamada descarboxilase lisina. A reação chamada de descarboxilação oxidativa é a remoção irreversível de um CO2 do piruvato, gerando o grupo acetilque se liga à coenzima A (CoA), formando Acetil-CoA no Ciclo de Krebs. O meio Agar TSI (triple sugar iron) contêm glicose em pequena concentração, lactose em concentração superior, o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de ferro para a detecção desse produto final. Pode-se concluir que todas essas substâncias estavam presentes pois o teste ficou todo vermelho, ou seja, positivo. O ágar citrato permaneceu verde indicando que a Escherichia coli não utiliza o citrato como única fonte de carbono para o seu metabolismo. O teste de Indol feito no meio SIM prova que o microorganismo não produz indol a partir da molécula de triptofano ou outros aminoácido presentes no meio SIM. Quando ocorre a degradação deste aminoácido por bactérias que possuem a enzima triptofanase ocorre a formação de: Indol, ácido pirúvico e amônia. O negativo desse teste é verdadeiro pois o meio não ficou vermelho. VI. Bibliografia Acharya, Tankeshwar. Triple Sugar Iron Agar (TSI: Principle, Procedure and Interpretation. Disponível em:https://microbeonline.com/triple-sugar-iron-agar-tsi-principle-procedure-and-interpretation/. Acessado em: 11 jul. 2017 Marques, Leila Larissa M.Contagem de coliformes a 35°C(totais) e 45°C (termotolerantes) em alimentos Disponível em:http://paginapessoal.utfpr.edu.br/leilamarques/Micro%20alimentos%20Tecnologia/microbiologia-de-alimentos/coliformesroteiroparte2.pdf. Acessado em: 11 jul. 2017 Voges-Proskauer Reagent Droppers. Disponíve em:http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/L001126%280306%29_PT.pdf. Acessado em: 11 jul. 2017