Relatório da prática de microbiologia

       Introdução                                                                                  

                                                

Uma técnica muito presente em controle de qualidade e no cotidiano de microbiologistas são os testes bioquímicos. Testes esses, que apresentam como finalidade a identificação de algum tipo especifico de grupo ou espécie de bactéria ou levedura.

Para este fim, o teste bioquímico faz uso do conhecimento da reação enzimática dos diferentes microrganismos, em diferentes condições e por caráter eliminativo, identifica a espécie inicialmente desconhecida.

Antes de nos aprofundar um pouco mais nos tipos de teste bioquímico e como funcionam, é de suma importância o conhecimento do que é o meio de cultivo.

(1) Meio de cultivo:

Meio de cultivo é uma preparação química formulada com determinados nutrientes fundamentais para que o microrganismo se multiplique e desenvolva. Ele é composto principalmente por fontes de carbono e energia (açúcares), fósforo, sais minerais, nitrogênio.

Outros componentes podem ser encontrados em um meio de cultivo especifico para determinado organismo, satisfazendo as condições ideais para o mesmo.

Visto isso, retomamos ao ponto, quais são os tipos de testes bioquímicos. Existem diversos testes, toda via, foi feito uso no decorrer deste procedimento pratico dos seguintes testes:

1.    OF(oxidativo/fermentativo)

                 A.  Lactose (LAC)

                 B.  Glicose (GLI)

                 C.  Sorbitol (SB)

As bactérias utilizam carboidratos metabolicamente por processo fermentativo ou oxidativo, evidenciados pela produção de ácidos (alteração do pH do meio). Algumas bactérias podem metabolizar a os três tipos de carboidratos listados (A, B, C) somente sob condições aeróbicas, enquanto outras o fazem tanto aerobiamente como sob condições anaeróbicas.

A principal diferença entre o metabolismo fermentativo e o metabolismo oxidativo de um carboidrato e a necessidade de oxigênio atmosférico e a fosforilação inicial.

A fermentação é um processo anaeróbico que requer fosforilação inicial do carboidrato antes da degradação a ácidos mistos relativamente fortes, enquanto que a oxidação é um processo estritamente aeróbico, que envolve oxidação direta de uma molécula de carboidrato não fosforilada inicialmente. Os ácidos formados no processo aeróbico são mais fracos e difíceis de detectar que os do processo anaeróbico.

Sendo estipulado:

Tubo com óleo sendo: fermentativo

Tubo sem óleo: oxidativo

2.    Descarboxilação:

                  A.  Ornitina

                  B.  Lisina

                  C.  Arginina

Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar as diferentes substancias (A, B, C), por ação de enzimas descarboxilase.

3.    SIM (Sulfeto/Indol/Motilidade)

O meio SIM é um meio semissólido usado para determinação da produção de indol e H2S e motilidade. O citrato ferroso de amônio e tiossulfato de sódio são usados para detectar produção de gás H2S.

4.    LIA (lisina iron agar)

O Ágar de ferro lisina ajuda na diferenciação de bacilos entéricos com base na sua capacidade de descarboxilação e desaminação da lisina para produzir ácido sulfídrico.

5.    TSI (triple sugar iron)

A formulação do Agar TSI através da adição de sacarose à formulação com dois açúcares (glucose e lactose) do Agar de ferro de Kligler. O Agar de ferro com três açúcares contém três hidratos de carbono (glucose, lactose e sacarose). Quando estes hidratos de carbono são fermentados, a produção resultante de ácido é detectada pelo indicador vermelho de fenol. As alterações da cor resultantes são o amarelo para a produção de ácido e o vermelho para alcalinização.

Uma vez que a lactose e a sacarose estão presentes em concentrações muito mais elevadas do que a glucose, a formação ácida na base deve-se a estes açúcares, enquanto a formação ácida de glucose é suprimida por uma oxidação rápida da pequena quantidade de ácido na área inclinada do tubo. Tal resulta numa reação neutra ou alcalina do pH quando apenas a glucose é fermentada.

Num pH neutro ou alcalino, o sulfureto de hidrogénio (produzido a partir de tiossulfato de sódio) reage ao sal de amónio ferroso, resultando num sulfureto de ferro preto. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico do meio.

A aplicação original da fórmula TSI consiste na sua utilização como um meio preparado em tubos, contendo uma área no limite e uma área inclinada. Este meio permite a diferenciação dos fermentadores da glucose, lactose, e/ou sacarose e a detecção da produção de sulfureto de hidrogénio.

A maioria das estirpes de Proteus, conhecidas por produzirem sulfureto de hidrogénio a um pH neutro ou alcalino, acidificam o meio visto que fermentam a sacarose e não aparecerão com uma cor preta. Por outro lado, as estirpes de Salmonella que não fermentam a sacarose nem a lactose produzem colónias pretas.

6.    Citrato

O teste é feito semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde.

A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citratase resulta na formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato há formação de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul.

Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos.

7.    MRVP

Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos.

A glicose é o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produção de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimático presente na bactéria.
Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reação positiva.

Quando o pH é 6, apesar de ainda ser ácido, como há menos ions de hidrogénio, o indicador muda para amarelo e é uma prova negativa.

Objetivo

Esse experimento tem como principal finalidade identificar a bactéria utilizada nesse ensaio, a partir das analises do seu comportamento em diferentes meios de cultura por testes bioquímicos.

Material e métodos

Para semear a bactéria nos meios líquidos com e sem óleo e nos meios inclinados com exceção do tubo contendo Agar Citrato, fez-se necessário flambar a alça e deixar esfriar. Retirou-se a tampa de rosca do tubo e retirou-se com a agulha uma porção da amostra. Fechou-se o tubo que continha a amostra e logo após retirou-se a tampa do tubo inoculado. Introduziu-se a alça até aproximadamente ¼ de profundidade do meio e fechou-se o tubo.

No tubo de meio sólido inclinado de Agar Citrato de Simmons, foi realizado uma técnica específica. Flambou-se a alça e após deixar esfriar, retirou-se a tampa de rosca do tubo que continha a bactéria e retirou-se uma porção da amostra com a alça. Colocou-se a tampa no tubo que continha a amostra e retirou-se tampa do tubo que foi inoculado. Introduziu-se a alça até a base da superfície do meio inclinado, passando ao longo da sua superfície em movimento zig-zag e fechou-se o tubo.                                         

Após todos os tubos serem inoculados com a bactéria, os mesmos foram incubados à 37°C por 24 horas.

Resultados

TUBOS	RESULTADO
	POSITIVO	NEGATIVO
SIM		x
MR		x
VP		x
CITRATO	x
LIA	x
TSI	x
LIS	x
ARG		X
ORG		X
SB oxi	x
SB fer	x
GLI oxi	x
GLI fer	x
LAC oxi	-	-
LAC fer	-	-

                  Tabela 1: relaciona cada meio com seu respectivo resultado.

Meios de cultura:

ü  SIM- Sulfeto Indol Motilidade.

ü  MR- Metil Red.         

ü  VP- Voges-Proskauer.

ü  CITRATO- Agar Citrato de Simmons.

ü  LIA- Lisina Iron Agar.

ü  TSI- Triple Sugar Iron.

ü  LIS- Lisina.

ü  AGR- Arginina.

ü  ORG- Orginia.

ü  SB oxi- Sorbitol (meio oxidativo).

ü  SB fer- Sorbitol (meio fermentativo).

ü  GLI oxi- Glicose (meio oxidativo).

ü  GLI fer- Glicose (meio fermentativo).

ü  LAC oxi- Lactose (meio oxidativo).

ü  LAC fer- Lactose (meio fermentativo).

                        Tubos com os meios de cultura antes de adicionar a bactéria.

Figura 1 : Meios de Triple Sugar Iron e Lisina Iron Agar”.

     

Figura 2 :Meios de  Metil Red e Voges-Proskauer(MRVP).  

  Figura 3:Meios de Sorbitol e Glicose fermentativos.

                                                

                                                             Figura 4:Meios de Glicose e Sorbitol oxidativos
                                                                                                                            

  Figura 5: Meios de Orginina e Lisina. 

 Figura 6: Meio Arginina.  

Figura 7: Tubo controle.

                  

                                                                             

 Figura 8: Meio de Lactose oxidativo. 

Figura 9:Meio de Lactose fermentativo.

                    

Figura 10: Meio Agar Citrato de Simmons.  

                               

    Figura 11: Meio Sulfeto Indol Motilidade.

              

            Tubos com os meios de cultura após adicionar a bactéria.

                         

Figura 12: Meio de Glicose fermentativa e Arginina.

                                    

Figura 13: Meios de Lactose e Glicose oxidativas.

          

                        

   Figura 14: Meio de Orginina e Sorbitol oxidativo. 

                        

   Figura 15:Meio de Sorbitol Oxidativo e Metil Red.

Figura 16: Tubo controle e Meio Sulfeto Indol Motilidade.

Figura 17:Meio Lactose fermentativo e Vorges Proskraues.

  Figura 18: Meios de Triple Sugar Iron e Agar Citrato Simmons.  

 Figura 19: Meios de Lisina Iron Agar e Lisina.

            Como é possível observar através das fotos anteriores, após a adição da bactéria e incubação à 37°C por 24 horas, a maior parte dos tubos contendo diferentes meios, sofreram uma mudança de cor aparente que resultou na possibilidade de responder se o teste bioquímico era positivo ou negativo para determinada bactéria em determinado meio.

            As explicações e causas para essas mudanças serão abordadas mais a frente na discussão.

Discussão

Os resultados de cada tubo foram estudados minuciosamente e cada cor comparada com resultados esperados para as respectivas bactérias.

·         Meios OF

O meio de glicose e sorbitol obteve crescimento tanto no tubo com óleo, quanto no sem óleo. Afinal ouve mudança de cor de verde para amarelo. Isso significa que essa bactéria tem capacidade de hidrolisar açúcares por fermentação e oxidação. Já em ambos tubos contendo os meios de lactose, fermentativo e oxidativo, não obteve-se um resultado esperado ou claro para determinar se o teste foi positivo ou negativo.

·         Meio citrato

O tubo de citrato também obteve crescimento de bactéria, pois ouve mudança de cor do verde para o azul. O que significa que a bactéria desse experimento utiliza o citrato como sua única fonte de carbono.

·         Meio TSI

O Resultado do meio TSI nos mostra que ocorre uma fermentação da glicose em anaerobiase, produção de H₂S e produção de alcalinidade na superfície do meio.

·         Meios de descarboxilação

Os meios contendo arginina e orginina não obtiveram mudança alguma de cor, o que  indica que a bactéria é incapaz de interagir com os grupos carboxilas. Obteve-se uma mudança de cor apenas no tubo contendo o meio lisina, indicando um resultado positivo e inesperado.

·         MRVP

Esse teste não obteve mudança de cor, o que significa que o seu ph é acima de 6,2.

·         Meio Sim

Obteve-se resultado negativo para o meio SIM, apesar de ter sido observada uma leve alteração de cor. Isso significa que a bactéria em questão não tem capacidade de metabolizar o tripitofano no indol.

Acredita-se que a bactéria utilizada nesse experimento seja a bactéria Salmonella spp., em vista do resultado no meio TSI que trata-se de um resultado de cores típico dessa bactéria.

Conclusão

Após a análise do comportamento da bactéria em diversos meios, acredita-se que a bactéria utilizada nesse experimento seja a bactéria Salmonella spp., em vista do resultado no meio TSI que trata-se de um resultado de cores típico dessa bactéria.

  Bibilografia

BD. Bbl lysine iron agar slants. Disponível em: <http://www.bd.com/resource.aspx?idx=22847>. Acesso em: 08 jul. 2017.BD. Triple sugar iron agar (agar tsi). Disponível em: <http://www.bd.com/europe/regulatory/assets/ifu/hb/ce/pa/pt-pa-254458.pdf>. Acesso em: 08 jul. 2017.EBAH. Identificação de bactérias. Disponível em: <http://www.ebah.com.br/content/abaaafpowad/identificacao-bacterias>>. Acesso em: 09 jul. 2017.MBIOLOG. Meio sim. Disponível em: <http://www.mbiolog.com.br/?page_id=1456>. Acesso em: 08 jul. 2017.MICROBIOLOGIA BRASIL. Prova vermelho de metila – mr. Disponível em: <http://microbiologiabrasil.blogspot.com.br/2009/01/prova-vermelho-de-metila-mr.html>. Acesso em: 09 jul. 2017.Grupo Antraz: Karine Albuquerque, Lucas Da Nova, Maiara Cipriano e Monicke Azevedo.