Relatório de Testes Bioquímicos Grupo IV

I.                   Introdução

     A microbiologia procura conhecer e compreender o comportamento dos micro-organismos bem como suas relações com o ambiente e com outros micro-organismos e para isso utiliza-se de diversas metodologias, como por exemplo, os testes bioquímicos.

      Os testes bioquímicos visam estudar o comportamento dos micro-              organismos através de sua capacidade de degradar açúcares, lipídeos, aminoácidos e etc. Portanto, utilizam-se meios com a presença de compostos comuns no ambiente _ como glicose, lactose, lisina e arginina _ e agentes complexantes que tornam a reação colorimétrica. Desta forma, os testes podem ter dois resultados: positivo ou negativo. Caracterizam-se como positivos testes em que se observa mudança física no meio, geralmente mudanças de cor, chamadas de “viradas” do meio. Em contraposição, os testes negativos são aqueles em que não se observa uma virada do meio.

     É válido ressaltar que comumente realiza-se uma duplicata do teste, adicionando-se óleo mineral, para verificar se o bioanalito mantém sua atividade na ausência de oxigênio. Assim como a utilização de meios semissólidos é recorrente para verificar a mobilidade bacteriana.

     Os testes bioquímicos são realizados a partir da utilização de diversos meios com diferentes funções, como os apresentados abaixo:

·         Ágar Citrato Simmons (meio Citrato)

      Utilizado para verificar a utilização de citrato como fonte de carbono, o ágar citatro simmons apresenta coloração esverdeada e vira para azul devido a presença do azul de bromotimol.

·         Ágar lisina ferro (meio LIA)

      Utilizado para verificar a fermentação de lactose, apresenta-se na coloração marrom que passa ao púrpura, sendo o teste positivo.

·         Ágar MacConkey - com e sem óleo (meio LAC)

      Também verifica a fermentação de lactose alterando o pH e consequentemente a cor do meio de amarelo claro à vermelho.

·         Ágar MacConkey sorbitol - com e sem óleo (meio SB)

      Verifica a ocorrência da fermentação de sorbitol alterando a cor do meio, que originalmente é verde, para azul.

·         Ágar OF glicose - com e sem óleo (meio OF)

      Meio que verifica o metabolismo glicolítico sendo negativo nas colorações azul e verde, e positivo quando a coloração é amarelada.

·         Ágar triplo açúcar ferro (meio TSI)

      Apresenta três açucares em sua composição, além de sulfato ferroso de amônia verificando a fermentação de carboidratos em conjunto com a capacidade de conversão do sulfato presente no sal amoniacal em sulfeto de hidrogênio. O teste é negativo quando apresenta coloração avermelhada e, positivo, quando amarelado.

·         Caldo arginina (meio ARG)

      O caldo de arginina verifica a capacidade do bioanalito de converter a mesma em ornitina, a formação dessa molécula eleva o pH do meio que passa a apresentar coloração roxa. A fermentação do açúcar presente escurece levemente o amarelo do meio, mas, o resultado continua sendo negativo.

·         Caldo lisina (meio LIS)

     Seguindo o raciocínio do caldo de arginina, o caldo lisina busca verificar a capacidade do micro-organismo de desaminar a lisina. Quando positivo o meio vira de amarelo à roxo.

·         Caldo ornitina (meio OR)

      Utilizando o mesmo marcador, o caldo ornitina busca averiguar a capacidade de descaboxilação da ornitina, por intermédio do bioanalito. Quando positivo apresenta coloração arroxeada e, quando negativo, amarelada.

·         Meio Methyl Red, Voges-Proskauer (MRVP)

      O teste MR-VP verifica a metabolização dos produtos gerados a partir do metabolismo glicolítico. Sendo assim, ocorrem dois testes a partir do mesmo meio utilizando-se de diferentes soluções complexantes para revelar o resultado. As diferentes vias de metabolização dos produtos da glicolise variam o pH entre 4 e 6 gerando sempre um resultado positivo e outro negativo nos testes. Ambos os resultados positivos apresentam coloração avermelhada e coloração amarelada nos resultados negativos.

·         Meio SIM

      Verifica a produção de indol e sulfeto de hidrogênio além da motilidade devido à semissolidez do meio. O resultado positivo escurece o amarelo claro inicial.

II.                Objetivo

Os objetivos da prática consistem em analisar a eficácia dos testes bioquímicos e interpretar os resultados obtidos pelos mesmos. Através dos resultados, determinar também qual bactéria, não nomeada previamente, foi utilizada durante toda a prática.

III.             Materiais

·         Agulha;

·         Tubos de ensaio;

·         Alça;

·         Indicador vermelho de metila

·         Indicador α-naftol

·         Conta gotas

·         Bactéria S. aureus;

·         Alça bacteriológica;

·         Reativo de kovasc;

·         Álcool absoluto;

·         Meio SIM;

·         Caldo lisina (meio LIS);

·         Caldo arginina (meio Arg);

·         Caldo ornitina (meio OR);

·         Ágar MacConkey com óleo (meio LAC);

·         Ágar MacConkey sem óleo (meio LAC);

·         Ágar OF Glicose sem óleo (Meio OF);

·         Ágar OF Glicose com óleo (Meio OF);

·         Meio Methyl Red, Voges-Proskauer (MR – VP);

·        Ágar MacConkey com Sorbitol com óleo (meio SB);

·        Ágar MacConkey com Sorbitol com óleo (meio SB);

·         Ágar Citrato Simmons;

·         Ágar TSI – Triplo açúcar ferro;

·         Ágar lisina ferro (meio LIA);

IV.             Métodos

·         Ágar OF Glicose sem óleo (Meio OF)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida no tubo de ensaio estéril que previamente havia sido preenchido com meio OF sem óleo, inoculando assim o mesmo.

·         Ágar OF Glicose com óleo (Meio OF)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida no tubo de ensaio estéril que previamente havia sido preenchido com meio OF com óleo, inoculando assim o mesmo.

·         Meio SIM

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida até o centro de um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio SIM, inoculando assim o mesmo. Posteriormente, foi pingado o reativo de kovasc a esse tubo, com o auxílio de um conta gotas.

·         Meio Methyl Red, Voges-Proskauer (MR – VP)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio MR – VP, inoculando assim o mesmo. Esse procedimento foi realizado em dois tubos de ensaio.

Posteriormente, a um dos tubos adicionou-se o indicador vermelho de metila, já ao outro tubo foi adicionado α-naftol, com o auxílio de um conta gotas.

·         Ágar MacConkey com óleo (meio LAC)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio LAC com óleo, inoculando assim o mesmo.

·         Ágar MacConkey sem óleo (meio LAC)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio LAC sem óleo, inoculando assim o mesmo.

·        Agar MacConkey com Sorbitol sem óleo (meio SB)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio SB sem óleo, inoculando assim o mesmo.

·        Agar MacConkey com Sorbitol com óleo (meio SB)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio SB com óleo, inoculando assim o mesmo.

·         Ágar Citrato Simmons

Inicialmente, uma alça bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a alça foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio ágar Citrato Simmons,estriando apenas na rampa. Assim, o meio foi inoculado.

·         Ágar TSI – Triplo açúcar ferro

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida até o centro de um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio TSI, inoculando assim o mesmo.

·         Ágar lisina ferro (meio LIA)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida até o centro de um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio LIA, inoculando assim o mesmo.

·         Caldo arginina com óleo (meio ARG)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio ARG com óleo, inoculando assim o mesmo.

·         Caldo lisina com óleo (meio LIS)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio LIS com óleo, inoculando assim o mesmo.

·         Caldo ornitina com óleo (meio OR)

Inicialmente, uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido com meio OR com óleo, inoculando assim o mesmo.

V.                1. Resultados

Para os tubos MRVP e SIM que, só uma semana após a preparação dos tubos, tiveram os testes finalizados com a adição do reativo de Kovacs, vermelho de metila e alfemalitol, respectivamente, os resultados constam a seguir.

Meio de cultura	Cor do meio antes do teste	Cor do meio depois do teste	Resultado
SIM	Amarelado	Amarelado com superfície rosa	+
MRVP	Alaranjado	Vermelho	+
MRVP (15 minutos)	Alaranjado	Alaranjado	-

VI.             1. Discussão

Meio SIM

            Após o reativo de Kovacs ter sido pingado ao tubo com meio SIM e bactéria, houve a formação da coloração rosa na superfície do mesmo. Portanto, o resultado é positivo para produção de indol pela bactéria.

Meio MRVP

            Após a adição do indicador vermelho de metila, o meio mudou para o vermelho, indicando que o pH do meio é próximo a 4. Logo, a bactéria é capaz de oxidar a glicose.

Meio MRVP (15 minutos)

            Após a adição de alfemalitol ao meio, e tempo de espera de 15 minutos para que o tubo fosse olhado, a coloração do tubo não alterou. Portanto, já que não houve formação da coloração vermelho-tijolo, a bactéria não reagiu e nem formou acetoína.

V.             2. Resultados

            Para os outros tubos, que foram analisados uma semana após a realização do teste, o resultado pôde ser obtido sem mais nenhuma adição aos tubos. Seus resultados constam a seguir.

Meio de cultura	Resultado
TSI	+
LIA	+
Citrato	-
SIM	-
ARG (com óleo)	-
LIS (com óleo)	+
OR (com óleo)	-
SB (sem óleo)	+
SB (com óleo)	-
LAC (sem óleo)	+
LAC (com óleo)	+
OF Glicose (sem óleo)	+
OF Glicose (com óleo)	+

Tubos de meios SB com óleo, SB sem óleo, OR com óleo, LAC com óleo, LAC sem óleo, Citrato, TSI e LIA, respectivamente.

 

Tubos de meio ARG com óleo, LIS com óleo e SIM, respectivamente.

VI.             2. Discussão

·         Meio TSI

            A coloração do meio foi alterada de laranja escuro para amarelo, indicando resultado positivo para o teste. Logo, a bactéria é fermentadora de glicose, lactose e sacarose.

·         Meio LIA

            Houve alteração da cor do meio de marrom para roxo, indicando que o resultado é positivo para a descarboxilação de lisina pela bactéria.

·         Meio Citrato

            Como não houve alteração da cor do meio verde para azul, é possível concluir que a bactéria não utiliza citrato como fonte de carbono. Logo, o resultado do teste para utilização do citrato pela bactéria é negativo.

·         Meio SIM

A bactéria permanece somente onde a agulha teve contato com o meio. Dessa forma, é possível concluir que a bactéria não apresenta mobilidade, sendo negativo o teste para mobilidade da bactéria.

·         Meio ARG

            Não houve alteração da coloração do meio, amarelado, indicando um resultado negativo para o teste, ou seja, que a bactéria não descarboxila arginina.

·         Meio LIS

            A coloração do meio foi alterada, de amarelada para alaranjada, indicando um resultado positivo para o teste, ou seja, que a bactéria descarboxila lisina.

·         Meio OR

            A coloração do meio permaneceu amarelada, portanto, o resultado do teste é negativo, indicando que a bactérica não descarboxila ornitina.

·         Meio SB

            No meio SB sem óleo, o resultado do teste foi positivo, indicando que a bactéria realiza desaminação de proteínas, e que liberou aminas básicas e amônia (que conferiram a coloração azul na superfície da coloração). Já no meio SB com óleo, não houve nenhuma alteração no meio, logo, o resultado para o teste é negativo. Dessa forma, é possível concluir que a bactéria só consegue desaminar proteínas quando não há contato com oxigênio (impedido pelo óleo).

·         Meio LAC

            Houve alteração da coloração, de alaranjado para amarelado, nos dois tubos (com e sem óleo) de meio LAC, logo, os dois resultados foram positivos. Portanto, a bactéria fermenta a lactose em condições aeróbicas e anaeróbicas (quando há presença do óleo).

·         Meio OF Glicose

            Nos tubos de meio OF com óleo e sem óleo, o resultado do teste foi positivo para a fermentação da glicose. Logo, a bactéria é capaz é fermentadora de glicose quando há, e também quando não há, contato com o oxigênio.

            Com base nos resultados obtidos nos testes bioquímicos, é possível concluir que a bactéria utilizada foi a Staphylococcus aureus, pois suas características correspondem com as características obtidas: é uma bactéria anaeróbica facultativa (cresce na presença ou na ausência de oxigênio), gram-positiva e imóvel.

VI.             Conclusão

Obtem-se como conclusão a eficácia dos testes bioquímicos e menor custo dos mesmos quando comparados à outros métodos de testes com os mesmos fins. Além disso, também foi possível determinar qual bactéria, que não havia sido identificada, foi utilizada para a realização da prática, a Staphylococcus aureus.

VII.          Bibliografia

·         MADIGAN,M.T.;MARTINKO,J.M.;DUNLAP,PV;LARK,D.P. Microbiologia de Brock. 12. ed., Porto Alegre: Artemes, 2010. 1160p.

·         AGÊNCIA SANITÁRIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf>. Acesso em: 12 jul. 2017.

·  MBIOLOG DIAGNÓSTICOS. Caldo lisina. Disponível em: <http://www.mbiolog.com.br/?page_id=1442>. Acesso em: 10 jul. 2017.

·         MICROBIOLOGIA BRASIL. Prova vermelho de metila – MR . Disponível em: <http://microbiologiabrasil.blogspot.com.br/2009/01/prova-vermelho-de-metila-mr.html>. Acesso em: 10 jul. 2017.

·         NEOGEN CORPORATION. CALDO MR-VP (ISO) – MR-VP BROTH (7237). Disponível em: <http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7237_pt_pi.pdf>. Acesso em: 12 jul. 2017.