INOCULAÇÃO DE QUATRO BACTÉRIAS EM CINCO DIFERENTES MEIOS DE CULTURA (GRUPO 4)
A aula prática realizada no dia
13/09/18, no Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro consistiu na inoculação de quatro
bactérias em cinco meios de cultura, sendo cada uma delas inoculada em um dos
quatro quadrantes (delimitados por uma caneta de vidros) presentes nos meios. Os
meios de cultura utilizados e as bactérias neles inoculadas serão listados e
definidos na presente publicação.
Os objetivos do grupo 4 (composto por Matheus Machado, Gustavo Nogueira, João Pedro, Luana Alves e Livia Aparecida) em relação a tal prática foram as seguintes: pôr em prática as técnicas relacionadas à inoculação e à assepsia aprendidas em aulas anteriores e ter contato com meios de cultura não utilizados anteriormente (a fim de que fosse despertado o interesse pela compreensão da relação entre eles e as bactérias inoculadas).
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS
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Meio de cultura Ágar MYP:
O Ágar MYP é um meio de cultura que possui a finalidade de isolar e
conter a Bacillus cereus em alimentos em geral. Dentre os Ágares de seu tipo, ele
possui a vantagem de demonstrar, seja quantitativamente ou qualitativamente, a
bactéria B. cereus, pois esta se ajusta de forma ideal às suas características.
Figura 1: Meio de cultura Ágar MYP antes da inoculação das bactérias.
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Meio de cultura Ágar nutriente (AN):
O ágar nutrientes é um dos meios mais fáceis de de se preparar, pois além
de ser barato, é muito usado em procedimentos. Devido aos fatores citados
anteriormente, trata-se de um meio relativamente simples. Tal meio é ideal para
diversas coisas como: isolamento de culturas puras, conservação e manutenção de
culturas em temperaturas ambientes para laboratórios que não tem o método de
criopreservação, análise de água e alimentos submetidos à exames
bacteriológicos.
Figura 2: Meio de cultura Ágar Nutriente antes da inoculação das bactérias.
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Meio de cultura Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB):
O meio EMB Agar (do inglês "eosin methylene blue agar" ágar
eosina azul de metileno) é utilizado para isolar enterobactérias (as quais se
estabelecem nas paredes do intestino) gram-negativas, de modo que permite a
identificação destas como clínicas ou não-clínicas.
Tal meio atua inibindo o crescimento de bactérias gram-positivas, em
certo grau. Seu mecanismo de diferenciação e isolamento é baseado na resposta à
fermentação de carboidratos (lactose e sacarose)
No caso de coliformes, por exemplo, a coloração adquirida pelas colônias
no meio é negra arroxeada, visto que elas utilizam a eosina azul de metileno,
em situações de queda de pH – após fermentação de carboidratos. No caso da Escherichia
coli, a coloração é verde metalizada com centro negro. As bactérias que não
fermentam a lactose devem causar elevação do pH do meio a partir de desaminação
oxidativa de proteína, havendo solubilização da eosina azul de metileno,
tornando as colônias incolores.
Figura 3: Meio EMB (ágar eosina azul de metileno) antes da inoculação das bactérias.
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Meio de cultura Ágar cetrimida (CET):
O meio de cultura Ágar cetrimida é o meio seletivo adequado para o
isolamento e contagem da bactéria gram-negativa Pseudomonas aeruginosa.
Geralmente, faz-se análise desta por meio de amostras biológicas de origem
animal e produtos farmacêuticos e cosméticos. Sua composição é a dada pela
Farmacopéia Americana. Este meio é muito utilizado na área de fabricação de
produtos de beleza, para testar a presença desta bactéria, que não é permitida
nestes produtos.
Possui coloração âmbar claro, e na presença da bactéria torna-se azul ou azul-esverdeado. A
incompleta fusão do ágar durante a preparação dele, poderá levar a uma
significativa inconsistência na formação do gel no ágar solidificado, após
esterilização e resfriamento.
Figura 4: Meio Ágar CET anteriormente à inoculação das bactérias.
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Meio de cultura ágar manitol:
Esse meio é utilizado para isolar estafilococos, sendo
seletivo para Staphylococcus aureus, bactéria que
fermenta o meio, alterando o pH deste e tornando-o amarelo.
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Figura 5: Meio ágar manitol anteriormente à inoculação das bactérias
BACTÉRIAS INOCULADAS
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Escherichia coli:
A Escherichia coli, ou E. Coli, é uma enterobactéria gram-negativa que
constitui cerca de 0,1% da flora intestinal dos seres endotérmicos, isto é, de
sangue quente.
A maior parte de suas estirpes (cepas, ou seja, linhagem) são não-patogênicas. Porém, alguns
sorotipos são responsáveis por causar intoxicação alimentar nos humanos. Dentre os sintomas observados para doenças envolvendo E. Coli, estão: diarreia, vômito, náuseas, febres baixas, desidratação e cólicas.
No
homem, as estirpes constituidoras da flora são benéficas, atuando na produção
de vitamina K e ajudando a impedir que ali se estabeleçam outras bactérias
patogênicas.
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Staphylococcus aureus:
O Staphylococcus aureus, ou S. aureus, é uma bactéria gram-positiva muito comum no
nosso dia a dia, encontrada na pele e nas mucosas, principalmente na boca e no
nariz. Porém, não oferece riscos, contanto que não haja feridas e o sistema
imunológico esteja comprometido.
A bactéria pode se proliferar na corrente
sanguínea. A infecção pode variar de uma simples infecção, como a foliculite,
ou uma infecção mais grave, como a endocardite, quando a bactéria atinge o
coração, causando dores musculares e hemorragias.
Essa espécie também está presente em ambientes hospitalares. Geralmente o
S. aureus é encontrado em hospitais, onde podem apresentar resistência a antibióticos,
dificultando seu tratamento.
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Bacillus cereus:
A bactéria Bacillus cereus é caracterizada como gram-positiva, apresentando
forma de bastonetes grandes que produzem esporos, sendo aeróbica ou anaeróbica
facultativa. Ela é responsável pela produção das enterotoxinas não-hemolítica e
hemolisina (as quais são sintetizadas
enquanto a bactéria se encontra em crescimento vegetativo, no hospedeiro), que
ocasionam diarreia, além da cereulida (sintetizada na fase estacionária de
crescimento), a qual é termorresistente e causadora de náuseas e vômitos
(sintomas que caracterizam a chamada síndrome emética). Tais enterotoxinas são
pouco produzidas em condições anaeróbicas, apesar de a B. cereus ser anaeróbica
facultativa.
Tal bactéria é patogênica, estando envolvida em diversos casos de
intoxicação alimentar, sendo os alimentos frescos (como frutos, legumes e
verduras) os mais comumente contaminados pela bactéria em questão. A quantidade
mínima de B.cereus num alimento para que a intoxicação alimentar se desenvolva
é de 105 a 106 células por grama de alimento.
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Salmonella entérica:
A Salmonella enterica (chamada antigamente de Salmonella
choleraesuis) é uma bactéria gram-negativa aeróbica facultativa em forma de
bastonete, flagelada e uma espécie do gênero Salmonella. Algumas de suas cepas são patógenos
humanos sérios.
PROCEDIMENTOS REALIZADOS
Durante a prática em questão, foram realizados os seguintes procedimentos:
As cinco placas de Petri contendo os meios citados tiveram sua base externa marcada com uma caneta de vidro, sendo delimitados quatro quadrantes (a partir de dois segmentos de reta perpendiculares).
Na zona de assepsia (raio da chama do bico de Bunsen), considerando momentos diferentes para cada uma das placas de Petri, a alça bacteriológica foi aquecida ao rubro e, posteriormente, esfriada espontaneamente.
Em seguida, o tubo de ensaio contendo a bactéria Escherichia Coli foi aberto, sendo sua extremidade superior flambada três vezes. Na sequência, a alça foi imergida no tubo contendo a bactéria em questão. Sendo retirada do tubo, a alça foi utilizada para realizar movimentos de zigue-zague no primeiro quadrante da placa de Petri contendo o meio que se pretendia inocular (tal placa também estava na zona de segurança).
Após isso, a placa foi fechada e os procedimentos anteriores foram repetidos para cada bactéria. No segundo quadrante, foi inoculada a bactéria S. aureus; no terceiro, a B. cereus; no quarto, a S. enterico.
O mesmo procedimento foi realizado para os todos os meios de cultura.
EXPECTATIVAS E RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DAS INOCULAÇÕES
*Para todos os casos, os quadrantes 1 e 2 encontram-se superiormente, à esquerda e à direita, respectivamente. Os quadrantes 3 e 4 localizam-se inferiormente, à esquerda e à direita, também respectivamente.
*Os resultados foram observados no dia 27/09/18.
➔ Meio de cultura Ágar MYP
Figura 6: Crescimento das bactérias em questão no meio MYP.
Esperava-se que o crescimento
da Escherichia coli fosse inibido ou retardado nesse meio,
mas, caso suas colônias fossem recuperadas, esperava-se que suas adjacências
fossem coloridas de amarelo. Tal expectativa foi observada no primeiro
quadrante.
No que tange ao
Staphylococcus aureus, era esperado que houvesse seu crescimento e que o meio
ocupado pelas colônias adquirisse tom amarelo – o que foi observado no segundo
quadrante.
Esperava-se que a
bactéria Bacillus cereus se desenvolvesse em tal meio, de
forma que suas adjacências fossem coradas de rosa, pois essa bactéria não
fermenta o manitol. com a observação de halos opacos em volta das colônias,
devido à positividade para lectinase. Todos esses aspectos foram observados no
terceiro quadrante, onde a bactéria em questão foi inoculada.
Em relação à Salmonella enterico, inoculada no quarto quadrante, não foram encontradas expectativas na literatura. Entretanto, parece ter ocorrido seu crescimento, com coloração amarela no meio.
➔ Meio de cultura Ágar nutriente (AN)
Figura 7: Crescimento das bactérias em questão no meio ágar nutriente (AN).
No meio ágar nutriente, devido ao fato de este ser pouco seletivo, eram esperados os crescimentos das bactérias Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Bacillus aureus e Salmonella enterico, os quais
foram observados nos respectivos quadrantes.
➔ Meio de cultura Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Figura 8: Crescimento das bactérias em questão no meio eosina azul de metileno (EMB).
No
meio EMB, era esperado que as bactérias Escherichia
coli crescessem apresentando colônias escuras-azuladas, com exibição de um
reflexo verde metalizado. Isso foi observado no primeiro quadrante, onde tal
bactéria foi inoculada. Entretanto, a fotografia não permitiu sequer a visualização das colônias.
Em
relação à bactéria Staphylococcus aureus
e à Bacillus cereus, esperava-se que
seus crescimentos fossem inibidos, uma vez que se tratam de bactérias
gram-positivas (esse tipo de bactéria é inibido por tal meio). Elas foram
inoculadas no segundo e no terceiro quadrantes, respectivamente, nos quais não houve observação de colônias, como pode ser observado a partir da imagem (*os pontos brancos presentes no terceiro quadrante são marcas da superfície utilizada para apoiar a placa de Petri, não sendo, portanto, contaminação).
Esperava-se,
ainda, a observação de colônias grandes de Salmonella
entérico, com coloração incolor ou âmbar. As colônias observadas no quarto quadrante foram de dimensões médias, com coloração bege.
➔ Meio de cultura Ágar cetrimida (CET)
Figura 9: Crescimento das bactérias em questão no meio ágar cetrimida. Nesta fotografia, o primeiro e o segundo quadrantes são representados, respectivamente, à direita e à esquerda. O terceiro e o quarto quadrantes estão à direita e à esquerda, respectivamente.
Considerando-se o meio ágar cetrimida, a expectativa era que a Escherichia coli tivesse seu crescimento
inibido integralmente. Isso pôde ser corroborado com a inoculação dessa
bactéria no primeiro quadrante do meio em questão (destaca-se que o meio desse
quadrante foi parcialmente derretido pela alça bacteriológica quente, por isso
o aspecto observado na fotografia). Uma provável contaminação foi observada,
como uma unidade formadora de colônia, no canto inferior direito deste quadrante.
Para a bactéria Staphylococcus
aureus, esperava-se a inibição parcial ou integral do crescimento. Como
resultado, não foram observadas unidades formadoras de colônia no quadrante em
que foi inoculada (segundo).
Em relação ao Bacillus cereus,
era esperado que seu crescimento pudesse ocorrer ou não, tendo em vista que
alguns fermentadores e esporoformadores (como as bactérias da espécie Bacillus)
desenvolvem-se ocasionalmente nesse meio, realizando a produção de pigmentos
castanhos ou amarelados. Para essa bactéria, o resultado foi a inibição do crescimento.
Sobre a bactéria Salmonella enterico, não foram encontradas informações sobre seu crescimento no meio em questão. Entretanto, foi observado o crescimento de colônias brancas.
➔ Meio de cultura ágar manitol
Figura 10: Crescimento das bactérias em questão no meio manitol.
Esperava-se que apenas o Staphylococcus
aureus se
desenvolvesse nesse meio (o qual é altamente seletivo para essa bactéria),
tendo em vista que correspondia ao único estafilococos dentre as outras bactérias
inoculadas (tal meio permite o crescimento de estafilococos). Como explicado
anteriormente, essa bactéria altera o pH do meio a partir da fermentação,
tornando-o amarelo. Isso foi observado no quadrante em que ela foi inoculada
(segundo).
No entanto, observou-se contaminação no terceiro quadrante.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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