Relatório - Testes Bioquímicos

Introdução

Os testes bioquímicos servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo.

O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de propriedades. Portanto, quanto menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação.

Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento, utilizando organismos como controles positivos e negativos para a execução de cada teste.

As características culturais podem ser observadas em meios líquidos e sólidos inclinados (em tubos).

As principais características observadas em meio líquido são:

1.      Tipo de crescimento na superfície - sem crescimento, película, grumosa, membranosa, anel (circular);

2.      Opacidade ou turvação - nula, ligeira ou suave, regular, intensa, transitória, persistente;

3.      Cheiro - nenhum, pronunciado, semelhante a ...;

4.      Sedimento - compacto, grumoso, viscoso, granular, escamoso, quantidade do sedimento (abundante, escasso, nulo).

As principais características observadas em meio sólido inclinado são:

1.      Crescimento - nulo, escasso, abundante;

2.      Pigmentação - cor;

3.      Lustro ou brilho - fosco, luzidio;

4.      Caracteres ópticos - transparência, translúcido ou opaco;

5.      Fluorescência - positiva, negativa (em fonte de luz UV);

6.      Consistência - butirosa, viscosa, membranácea, quebradiça;

7.      Emulsionabilidade - nula, fácil, difícil;

8.      Odor - ausente, presente, semelhante a ....

Isolamento

Para o isolamento dos bacilos gram-negativos são utilizados principalmente meios seletivos diferenciais. Podendo estes serem: Ágar salmonella Shigella (SS), Ágar Verde Brilhante, Ágar Eosina Azul de Metileno e outros. Para esta pratica em questão foi usado o Ágar MacConkey ou LAC, que após ser inoculado foi encubado a 37ºC, assim como os demais meios, para fazer a diferenciação e identificação bioquímica.

Utilização do citrato como única fonte de carbono

A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de Citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citratase resulta na formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato há formação de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos.

Prova da produção de indol

O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. A prova é realizada inoculando-se o meio SIM contendo excesso de triptofano. Após a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (solução aquosa ou alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente) através da parede interna do tubo. A prova é positiva quando na porção superior desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de no máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom)

Teste de Motilidade

A prova de motilidade indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova bioquímica e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta o meio semi-sólido SIM. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio.

Produção de H₂S

Algumas bactérias são capazes de hidrolizar aminoácidos sulfurosos e produzir H₂S. Esse produto pode ser evidenciado pela adição de compostos inorgânicos com ferro. A enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Na reação positiva O sulfeto de hidrogênio na presença de sais de ferro (presentes no meio SIM) forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel. Se houver ausência de precipitado negro no tubo o resultado é negativo. 

Fermentação Acido Mista

Algumas vezes é necessário verificar se a bactéria produz vários ácidos (fermentação ácido mista), comum para E. coli, através do teste chamado de Vermelho de metila (VM) ou Metil Red (MR) que é a prova efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produção e estabilização de altas concentrações de produtos finais ácidos. Serve para diferenciar organismos entéricos, em particular E. coli de E. aerogenes. Todas as enterobactérias fermentam glicose. Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando a redução do pH abaixo de 4,4 (viragem do indicador). Porém, algumas durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado, pH 6. Sendo assim, pH abaixo de 4,4 é vermelho, acima de 6 é amarelo.

Fermentação Butileno-glicólica

Há bactérias que utilizam a fermentação butileno-glicólica revelada pela detecção de acetil-metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos, que são produzidos a partir da fermentação da glicose pelas bactérias. Este teste é feito através do teste conhecido como VP ou Voges-Proskauer. Quando KOH é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil, A adição de alfa-naftol nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo, após 10 a 15 minutos.

Metabolismo Bacteriano

O meio de TSI fornece uma série de reações bioquímicas que dão uma visão geral do metabolismo bacteriano. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H₂S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio é semeado com agulha na base e estrias na superfície. Após o crescimento da bactéria pode-se observar os seguintes resultados:

1-              A bactéria não fermenta qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio, ou até mesmo utiliza os aminoácidos respirando-os com produção de aminas que alcalinizam o meio;

2-              Fermenta somente a glicose de tal sorte que os ácidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinação vermelha por utilização dos aminoácidos (por respiração), alcalinizando a mesma e neutralizando a pequena quantidade de ácidos, pois a concentração de glicose é baixa - assim o resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e base ácida);

3-              Fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas, pois os álcalis produzidos na inclinação são facilmente neutralizados pela grande quantidade de ácidos produzidos

Teste da lisina descarboxilase

Consiste em determinar a habilidade enzimática de uma determinada bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina alcalina (cadaverina). O meio utilizado é o meio LIA ou Ágar Lisina Ferro que contém como indicador o Púrpura de bromocresol, podendo ter os seguintes resultados: Positivo, cor púrpura (alcalino), expressa que ocorreu a descarboxilação da lisina e consequente formação de aminas. Negativo, meio amarelo (ácido), não ocorreu a descarboxilação da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.

Descarboxilação de Aminoácidos

A descarboxilação é um processo em que a bactéria que possui uma enzima específica para descarboxilação ataca o grupo carboxil presente no aminoácido, produzindo uma amina ou diamina e dióxido de carbono. Existem inúmeras enzimas de descarboxilação, cada uma específica para um tipo de substrato. Em um laboratório de bacteriologia clínica, as descarboxilases mais importantes para identificação bacteriana são Lisina (LIS), Arginina (ARG), Ornitina (OR) que são aminoácidos utilizados para este teste. São utilizados para verificar a habilidade enzimática de um organismo em descarboxilar um aminoácido e formar uma amina, alcalizando o meio. O teste é tido como positivo quando há turbidez ou mudança de coloração ao se comporar ao meio tubo controle. E negativo quando não há nenhuma alteração do tubo controle.

Meio OF

Permite verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa. O que ajuda na diferenciação de bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos. Podendo obter os seguintes resultados:

Objetivos

Conhecer os princípios das provas bioquímicas utilizadas na identificação de espécies microbianas. A fim de executar e interpretar os resultados e as transformações metabólicas ocorridas em algumas provas bioquímicas empregadas para identificação de bactérias.

Materiais:

·      1 agulha bacteriológica;

·      Bico de Bunsen;

·      Amostra da bactéria.

·      1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Ágar Lisina Ferro (LIA)

·      1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Ágar citrato de simmons

·      1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Ágar TSI – triplo açúcar ferro

·      1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Methyl Red (MR)

·      1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Vogel Proskauer (VP)

·      2 tubos de ensaio contendo OF Sorbitol (SB)

·      1 tubo de ensaio contendo meio de cultura SIM

·      1 tubo de ensaio contendo meio base para aminoácidos com arginina (ARG)

·      1 tubo de ensaio contendo meio base para aminoácidos com ornitina (OR)

·      1 tubo de ensaio contendo meio base para aminoácidos com  lisina (LIS)

·      2 tubos de ensaio contendo OF  lactose (LAC)

·      2 tubos de ensaio contendo OF Glicose (GLI)

·      Indicador de pH vermelho de metila

·      Reagente Voges-Proskauer (KOH 40%).

·      Reagente de Kovac

Métodos

Ao iniciar os procedimentos da prática, flambou-se a agulha bacteriológica em um ângulo de 90° com o auxílio do bico de Bunsen. Em seguida, flambou-se três vezes a amostra que continha a bactéria desconhecida e inseriu a agulha bacteriológica na amostra, ao inocular a bactéria aos tubos de ensaio que continham os meios de cultura, precisou flambar as extremidades de cada tubo três vezes, com a finalidade de não ter contaminação e obter a esterilização do material. Todo o procedimento foi feito próximo e atrás das chamas.

Através das técnicas assépticas descritas, inoculou-se a bactéria desconhecida com o auxílio da agulha bacteriológica até metade dos tubos de ensaio que continham os meios de cultura Ágar Lisina Ferro e Ágar citrato de simmons, fazendo, em seguida, uma estria nas superfícies das rampas dos respectivos meios. Após isso, os tubos foram devidamente colocados na estante de tubos de ensaio.

Posteriormente, a bactéria foi inoculada até metade dos outros tubos de ensaio que continham: Ágar TSI, Methyl Red (MR), Vogel Proskauer (VP), Sorbitol (SB), SIM, Glicose (GLI),  Lactose (LAC), Lisina (LIS), Arginina (ARG) e Ornina (OR). Logo depois, os meios foram colados na estante de tubos e incubados a uma temperatura de 37°C. O meio base (controle) não foi inoculado.

Ao realizar a pratica para a visualização dos resultados, foi necessário acrescentar 0,5mL de indicador vermelho de metila, 0,5 mL de reagente Voges-Proskauer (KOH 40%) e 0,5 mL de reativo kovacs, nos meios de cultura: Methyl Red (MR), Vogel Proskauer (VP) e no meio SIM, respectivamente. 

Resultados

Figura 1. Tubos de MTVT e MRVP.

Os resultados apresentados para o MRVP (tubo da direita na figura 1) foram positivos, pois ele imediatamente após a adição do vermelho de metila ficou vermelho tijolo. O tubo de MRVT (o tubo da esquerda na figura 1) teve resultado negativo pois, depois de 15 minutos de observação, não ficou da cor vermelho tijolo.

   Figura 2. Tubo SIM.

O tubo SIM, apresentou resultado positivo, ficou com uma cor rosa na superfície.

Figura 3.  Tubos TSI, Citrato e LIA.

O Citrato (tubo do meio, de coloração verde) mostrou resultados negativos pois adquiriu uma coloração verde. O TSI (tubo mais a esquerda de coloração amarela), apresentou cor amarela e gerou gás, teve um resultado positivo. O LIA (meio de coloração vinho, tubo mais à direita) apresentou um resultado positivo com cor roxa.

Figura 4. Tubo base, ARG, OR, LIS.

Neste teste todos os tubos ficaram semelhantes ao tubo base, o teste foi inconclusivo.

Figura 5. Tubos LAC

Ambos os tubos LAC apresentaram resultados positivos mudando sua coloração para a vista na figura 5.

 Figura 6. Tubos O/F(os de coloração amarelada).

Os tubos O/F apresentaram resultados positivos para os testes, mudando as cores iniciais para a coloração amarelada mostrada na figura 6.

   

Tabela dos resultados:

Meios	OF (com óleo)	OF (sem óleo)	OR	LIS	ARG	SIM	LIA
¬/ü/ û	ü	ü	¬	¬	¬	ü	ü
Meios	TSI	2 LAC	MR	VP	CITRATO	2 GLI
¬/ü/û	ü	ü	ü	û	û	ü

Onde:

¬ - Inconclusivo

ü -  Positivo

û - Negativo

Discussão

Depois de realizados os procedimentos para os testes bioquímicos, pode-se fazer uma análise dos resultados obtidos.

No Teste TSI, um meio sólido com coloração vermelha-cereja antes de ser inoculado. Depois de inoculado, pode-se observar na figura tal no tubo tal que como a base e a ápice do tubo estavam na sua coloração amarela, é capaz de dizer que houve fermentação da glicose e da lactose e/ou sacarose (3 açúcares). Houve a presença de gás, pelo espaço que se encontra no final do tubo que levantou todo o meio. Entende-se que não houve presença do H2S, por não ter tido presença de um precipitado negro, já que o ferro não reagiu com sulfeto. Com base nesses resultados, a interpretação mais provável é de ser uma enterobactéria, que se caracterizam por serem fermentadores da glicose, com ou sem produção de gás, oxidase negativas e reduzem nitrato a nitrito. O levantamento do meio pelo gás é uma característica da E. Coli.

No teste LIA de meio sólido amarelo, antes da inoculação, permite analisar se descarboxila a lisina. Nesse teste, o resultado foi positivo, pois a mudança do amarelo para a cor púrpura indica que ocorreu a descarboxilação da lisina e consequentemente, a formação de aminas.

No teste do Citrato, que foi usado o meio Ágar Citrato de Simmons, um meio sólido com a coloração verde antes de inocular com a bactéria, é usado para observar se a bactéria usa o citrato como única fonte de carbono, o consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Seu resultado foi negativo, pois o meio continuou com a coloração verde, indicando que não houve crescimento microbiano no meio citrato. Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos. Alguns microrganismos como a E. coli não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula, não conseguindo, portanto, crescer no meio contendo como única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato.

No teste do Indol, usa-se o meio SIM e o reativo de Kovacs. O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. O resultado desse teste foi positivo, por ter formado na porção superior do tubo um anel de cor rósea dentro de 5 minutos depois da adição do reativo. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. A reação que ocorreu foi:

                            triptofanase

Triptofano               →→→        Indol + piruvato e amônia

No teste de MR-VP, (Methyl Red, Voges-Proskauer), meio líquido de cor alaranjada antes de inocular, ele determina a capacidade dos microrganismos de oxidarem a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. No teste MP teve o resultado positivo, pois a pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, comprovando a ocorrência de fermentação de glicose. O teste VP deu negativo, pois não se obteve uma cor vermelho-tijolo que é alcançada pela produção de acetsina que reage com alfa naftal. Esses resultados são característicos da Escherichia Coli.

O Teste do Meio O/F, teste de oxidação e fermentação de glicose serve, principalmente, para separar os gram-negativos fermentadores de glicose dos gram-positivos que não fermentam a glicose. De maneira geral, esse teste serve para analisar microrganismos quanto a maneira em que eles metabolizam a glicose. São dois tubos com um meio líquido verde que contém glicose e um indicador de pH, um deles possui óleo mineral/vaselina líquida acima do meio líquido para impedir a utilização de oxigênio pela bactéria crescendo em meio líquido. O resultado desse tubo foi positivo, pois os dois tubos ficaram amarelos, indicando que ela é capaz de fermentar e oxidar glicose, característica da E. Coli também.

Nos testes de ARG/OR/LIS (arginina, ornitina e lisina), que são usadas para verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificação, principalmente de enterobactérias, bacilos Gram-negativos não fermentadores e estafilococos. Os resultados desse teste foram inconclusivos, pois não houve nenhuma mudança de coloração e turbidez esperada, pode ter sido um erro na hora de inocular a bactéria.

Para o teste de Motilidade, usou-se o meio SIM.O teste obteve resultado positivo, pois houve formação de turbidez no tubo que parte da linha de inoculação feita com a agulha bacteriológica.

No meio SIM, havia um meio base para controle, que não houve inserção da amostra da bactéria. Meio líquido de coloração amarelo claro.

Os meios LAC, são líquidos e de coloração amarelada antes de inserida a bactéria, um dos tubos havia o óleo mineral no ápice do tubo, é um meio que fermenta lactose. Obtiveram-se resultados positivos, pela mudança de cor para laranja em ambos os tubos.

Conclusão

Conclui-se que foram usados princípios bioquímicos afim de identificar a espécie microbiana presente nos meios. A partir dos experimentos, as transformações metabólicas nos tubos nos levaram a identificar o microorganismo presente, que foi identificado como a bactéria E. Cohli.

Referências Bibliográficas

• TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia 10. Edição Porto Alegre: ARTMED, 2012. 894p.

•  MANDIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; DUNLAP, P.V. Microbiologia de Brock 12 edição. Porto Alegre: ARTMED, 2010. 1160p.