I.
Introdução
A microbiologia procura conhecer e
compreender o comportamento dos micro-organismos bem como suas relações com o
ambiente e com outros micro-organismos e para isso utiliza-se de diversas
metodologias, como por exemplo, os testes bioquímicos.
Os testes bioquímicos visam estudar o
comportamento dos micro-organismos
através de sua capacidade de degradar açúcares, lipídeos, aminoácidos e etc.
Portanto, utilizam-se meios com a presença de compostos comuns no ambiente-como glicose, lactose, lisina e arginina- e agentes complexantes que tornam a
reação colorimétrica. Desta forma, os testes podem ter dois resultados:
positivo ou negativo. Caracterizam-se como positivos testes em que se observa
mudança física no meio, geralmente mudanças de cor, chamadas de “viradas” do
meio. Em contraposição, os testes negativos são aqueles em que não se observa
uma virada do meio.
É válido ressaltar que comumente
realiza-se uma duplicata do teste, adicionando-se óleo mineral, para verificar
se o bioanalito mantém sua atividade na ausência de oxigênio. Assim como a
utilização de meios semissólidos é recorrente para verificar a mobilidade
bacteriana.
Os testes bioquímicos são realizados a
partir da utilização de diversos meios com diferentes funções, como os
apresentados abaixo:
- ·
Ágar Citrato Simmons (meio Citrato)
Utilizado para verificar a utilização de
citrato como fonte de carbono, o ágar citatro simmons apresenta coloração
esverdeada e vira para azul devido a presença do azul de bromotimol.
- ·
Ágar lisina ferro (meio LIA)
Utilizado para verificar a fermentação de
lactose, apresenta-se na coloração marrom que passa ao púrpura, sendo o teste
positivo.
- ·
Ágar MacConkey - com e sem óleo
(meio LAC)
Também verifica a fermentação de lactose
alterando o pH e consequentemente a cor do meio de amarelo claro à vermelho.
- ·
Ágar MacConkey sorbitol - com e sem
óleo (meio SB)
Verifica a ocorrência da fermentação de
sorbitol alterando a cor do meio, que originalmente é verde, para azul.
·
Ágar OF glicose - com e sem óleo
(meio OF)
Meio que verifica o metabolismo
glicolítico sendo negativo nas colorações azul e verde, e positivo quando a
coloração é amarelada.
- ·
Ágar triplo açúcar ferro (meio TSI)
Apresenta três açucares em sua
composição, além de sulfato ferroso de amônia verificando a fermentação de
carboidratos em conjunto com a capacidade de conversão do sulfato presente no
sal amoniacal em sulfeto de hidrogênio. O teste é negativo quando apresenta
coloração avermelhada e, positivo, quando amarelado.
- ·
Caldo arginina (meio ARG)
O caldo de arginina verifica a capacidade
do bioanalito de converter a mesma em ornitina, a formação dessa molécula eleva
o pH do meio que passa a apresentar coloração roxa. A fermentação do açúcar
presente escurece levemente o amarelo do meio, mas, o resultado continua sendo
negativo.
- ·
Caldo lisina (meio LIS)
Seguindo o raciocínio do caldo de
arginina, o caldo lisina busca verificar a capacidade do micro-organismo de
desaminar a lisina. Quando positivo o meio vira de amarelo à roxo.
- ·
Caldo ornitina (meio OR)
Utilizando o mesmo marcador, o caldo
ornitina busca averiguar a capacidade de descaboxilação da ornitina, por
intermédio do bioanalito. Quando positivo apresenta coloração arroxeada e,
quando negativo, amarelada.
- ·
Meio
Methyl Red, Voges-Proskauer (MRVP)
O teste MR-VP verifica a metabolização
dos produtos gerados a partir do metabolismo glicolítico. Sendo assim, ocorrem
dois testes a partir do mesmo meio utilizando-se de diferentes soluções
complexantes para revelar o resultado. As diferentes vias de metabolização dos
produtos da glicolise variam o pH entre 4 e 6 gerando sempre um resultado
positivo e outro negativo nos testes. Ambos os resultados positivos apresentam
coloração avermelhada e coloração amarelada nos resultados negativos.
Verifica a produção de indol e sulfeto de
hidrogênio além da motilidade devido à semissolidez do meio. O resultado
positivo escurece o amarelo claro inicial.
II.
Objetivo
Os
objetivos da prática consistem em analisar a eficácia dos testes bioquímicos e
interpretar os resultados obtidos pelos mesmos. Através dos resultados,
determinar também qual bactéria, não nomeada previamente, foi utilizada durante
toda a prática.
III.
Materiais
·
Agulha;
·
Tubos de ensaio;
·
Alça;
·
Indicador vermelho de metila
·
Indicador α-naftol
·
Conta gotas
·
Bactéria S. aureus;
·
Alça bacteriológica;
·
Reativo de kovasc;
·
Álcool absoluto;
·
Meio SIM;
·
Caldo lisina (meio LIS);
·
Caldo arginina (meio Arg);
·
Caldo ornitina (meio OR);
·
Ágar
MacConkey com óleo (meio LAC);
·
Ágar
MacConkey sem óleo (meio LAC);
·
Ágar OF Glicose sem óleo (Meio OF);
·
Ágar OF Glicose com óleo (Meio OF);
·
Meio Methyl Red, Voges-Proskauer (MR – VP);
·
Ágar MacConkey
com Sorbitol com óleo (meio SB);
·
Ágar MacConkey
com Sorbitol com óleo (meio SB);
·
Ágar Citrato Simmons;
·
Ágar TSI – Triplo açúcar ferro;
·
Ágar lisina ferro (meio LIA);
IV.
Métodos
·
Ágar OF Glicose sem óleo (Meio OF)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida no tubo de ensaio estéril que previamente havia sido preenchido com
meio OF sem óleo, inoculando assim o mesmo.
·
Ágar OF Glicose com óleo (Meio OF)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida no tubo de ensaio estéril que previamente havia sido preenchido com
meio OF com óleo, inoculando assim o mesmo.
·
Meio SIM
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida até o centro de um tubo de ensaio estéril, que previamente havia
sido preenchido com meio SIM, inoculando assim o mesmo. Posteriormente, foi
pingado o reativo de kovasc a esse tubo, com o auxílio de um conta gotas.
·
Meio Methyl Red, Voges-Proskauer (MR – VP)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio MR – VP, inoculando assim o
mesmo. Esse procedimento foi realizado em dois tubos de ensaio.
Posteriormente,
a um dos tubos adicionou-se o indicador vermelho de metila, já ao outro tubo
foi adicionado α-naftol, com o
auxílio de um conta gotas.
·
Ágar
MacConkey com óleo (meio LAC)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio LAC com óleo, inoculando assim o mesmo.
·
Ágar
MacConkey sem óleo (meio LAC)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio LAC sem óleo, inoculando assim o mesmo.
·
Agar MacConkey
com Sorbitol sem óleo (meio SB)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio SB sem óleo,
inoculando assim o mesmo.
·
Agar MacConkey
com Sorbitol com óleo (meio SB)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio SB com óleo,
inoculando assim o mesmo.
·
Ágar Citrato Simmons
Inicialmente,
uma alça bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a alça foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio ágar Citrato Simmons,estriando apenas na rampa. Assim, o meio
foi inoculado.
·
Ágar TSI – Triplo açúcar ferro
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida até o centro de um tubo de ensaio estéril, que previamente havia
sido preenchido com meio TSI, inoculando assim o mesmo.
·
Ágar lisina ferro (meio LIA)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida até o centro de um tubo de ensaio estéril, que previamente havia
sido preenchido com meio LIA, inoculando assim o mesmo.
·
Caldo arginina com óleo (meio ARG)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio ARG com óleo, inoculando
assim o mesmo.
·
Caldo lisina com óleo (meio LIS)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio LIS com óleo, inoculando assim o mesmo.
·
Caldo ornitina com óleo (meio OR)
Inicialmente,
uma agulha bacteriológica foi flambada no bico de Bulsen. Então, inseriu-se a
mesma em um tubo de ensaio contendo certa bactéria, em seguida, a agulha foi
introduzida em um tubo de ensaio estéril, que previamente havia sido preenchido
com meio OR com óleo, inoculando assim o mesmo.
V.
1.
Resultados
Para os tubos MRVP e SIM que, só uma
semana após a preparação dos tubos, tiveram os testes finalizados com a adição
do reativo de Kovacs, vermelho de metila e alfemalitol, respectivamente, os
resultados constam a seguir.
Meio de
cultura
|
Cor do meio
antes do teste
|
Cor do meio
depois do teste
|
Resultado
|
SIM
|
Amarelado
|
Amarelado com superfície rosa
|
+
|
MRVP
|
Alaranjado
|
Vermelho
|
+
|
MRVP (15 minutos)
|
Alaranjado
|
Alaranjado
|
-
|
VI.
1.
Discussão
Meio SIM
Após o reativo de Kovacs ter sido pingado ao tubo com
meio SIM e bactéria, houve a formação da coloração rosa na superfície do mesmo.
Portanto, o resultado é positivo para produção de indol pela bactéria.
Meio MRVP
Após a adição do indicador vermelho de metila, o meio
mudou para o vermelho, indicando que o pH do meio é próximo a 4. Logo, a
bactéria é capaz de oxidar a glicose.
Meio MRVP (15 minutos)
Após a adição de alfemalitol ao meio, e tempo de espera
de 15 minutos para que o tubo fosse olhado, a coloração do tubo não alterou.
Portanto, já que não houve formação da coloração vermelho-tijolo, a bactéria
não reagiu e nem formou acetoína.
V.
2. Resultados
Para os outros tubos, que foram
analisados uma semana após a realização do teste, o resultado pôde ser obtido
sem mais nenhuma adição aos tubos. Seus resultados constam a seguir.
Meio de
cultura
|
Resultado
|
TSI
|
+
|
LIA
|
+
|
Citrato
|
-
|
SIM
|
-
|
ARG (com óleo)
|
-
|
LIS (com óleo)
|
+
|
OR (com óleo)
|
-
|
SB (sem óleo)
|
+
|
SB (com óleo)
|
-
|
LAC (sem óleo)
|
+
|
LAC (com óleo)
|
+
|
OF Glicose (sem óleo)
|
+
|
OF Glicose (com óleo)
|
+
|
Tubos
de meios SB com óleo, SB sem óleo, OR com óleo, LAC com óleo, LAC sem óleo,
Citrato, TSI e LIA, respectivamente.
Tubos de meio ARG com óleo, LIS
com óleo e SIM, respectivamente.
VI.
2. Discussão
·
Meio TSI
A coloração do meio foi alterada de laranja escuro para
amarelo, indicando resultado positivo para o teste. Logo, a bactéria é
fermentadora de glicose, lactose e sacarose.
·
Meio LIA
Houve alteração da cor do meio de marrom para roxo,
indicando que o resultado é positivo para a descarboxilação de lisina pela
bactéria.
·
Meio Citrato
Como não houve alteração da cor do meio verde para azul,
é possível concluir que a bactéria não utiliza citrato como fonte de carbono.
Logo, o resultado do teste para utilização do citrato pela bactéria é negativo.
·
Meio SIM
A
bactéria permanece somente onde a agulha teve contato com o meio. Dessa forma,
é possível concluir que a bactéria não apresenta mobilidade, sendo negativo o
teste para mobilidade da bactéria.
·
Meio ARG
Não houve alteração da coloração do meio, amarelado,
indicando um resultado negativo para o teste, ou seja, que a bactéria não
descarboxila arginina.
·
Meio LIS
A coloração do meio foi alterada, de amarelada para
alaranjada, indicando um resultado positivo para o teste, ou seja, que a
bactéria descarboxila lisina.
·
Meio OR
A coloração do meio permaneceu amarelada, portanto, o
resultado do teste é negativo, indicando que a bactérica não descarboxila
ornitina.
·
Meio SB
No meio SB sem óleo, o resultado do teste foi positivo,
indicando que a bactéria realiza desaminação de proteínas, e que liberou aminas
básicas e amônia (que conferiram a coloração azul na superfície da coloração).
Já no meio SB com óleo, não houve nenhuma alteração no meio, logo, o resultado
para o teste é negativo. Dessa forma, é possível concluir que a bactéria só consegue
desaminar proteínas quando não há contato com oxigênio (impedido pelo óleo).
·
Meio LAC
Houve alteração da coloração, de alaranjado para
amarelado, nos dois tubos (com e sem óleo) de meio LAC, logo, os dois
resultados foram positivos. Portanto, a bactéria fermenta a lactose em
condições aeróbicas e anaeróbicas (quando há presença do óleo).
·
Meio OF Glicose
Nos tubos de meio OF com óleo e sem óleo, o resultado do
teste foi positivo para a fermentação da glicose. Logo, a bactéria é capaz é
fermentadora de glicose quando há, e também quando não há, contato com o
oxigênio.
Com base nos resultados obtidos nos testes bioquímicos, é
possível concluir que a bactéria utilizada foi a Staphylococcus aureus, pois suas características correspondem com as
características obtidas: é uma bactéria anaeróbica facultativa (cresce na
presença ou na ausência de oxigênio), gram-positiva e imóvel.
VI.
Conclusão
Obtem-se como conclusão a eficácia dos testes bioquímicos e menor custo
dos mesmos quando comparados à outros métodos de testes com os mesmos fins.
Além disso, também foi possível determinar qual bactéria, que não havia sido
identificada, foi utilizada para a realização da prática, a Staphylococcus aureus.
VII.
Bibliografia
·
MADIGAN,M.T.;MARTINKO,J.M.;DUNLAP,PV;LARK,D.P. Microbiologia de Brock. 12.
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Acesso em: 12 jul. 2017.
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Disponível em: <http://www.mbiolog.com.br/?page_id=1442>. Acesso em: 10
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