Relato das aulas práticas de Microbiologia

I. Introdução

    As práticas desempenhas ao longo do primeiro bimestre de 2017.2 auxiliaram a elucidar de forma sucinta todos os componentes essenciais para a compreensão da teoria ministrada nas aulas de Microbiologia, de forma que possamos aplicar a literatura lida em prática. As aulas desempenhadas no laboratório de microbiologia ao longo do G1 (primeiro bimestre) estavam de acordo com as temáticas abordadas em sala de aula, sendo estas: técnicas de preparo de material para autoclavar, recolhimento de microrganismos na placa de petri contendo meio sólido Ágar, método de coloração de gram (nessa prática, foi desempenhada também a aula para desenhar algo na placa de petri), técnicas para manuseio de material biológico no bico de bunsen e o método de esgotamento.

II. Técnicas de autoclavagem

   A primeira prática realizada no laboratório de Microbiologia teve como principal intuito elucidar de forma sucinta a técnica ideal para a preparação de vidrarias para o processo de autoclavagem. Antecedido o momento de autoclavagem de material, foi necessário preparar todas as vidrarias para esterilização. Placas de Petri, pipetas volumétricas de 5 mL e 1 mL e erlenmeyer de 200 mL foram embrulhados em jornal comum. 

Materiais embalados com papel Kraft.

• Pipetas volumétricas: para embrulhá-las de forma correta, as vidrarias foram posicionadas tangencialmente à bancada do laboratório, de forma que o jornal posicionado embaixo da pipeta pudesse ser enrolado a fim de deixar pequenas porções do papel nas extremidades do instrumento laboratorial. Além disso, colocou-se um pequeno pedaço de algodão limpo na porção superior da pipeta para que, após o processo de esterilização, estivesse pronta para utilização. No jornal, anatou-se o volume exato na parte externa;

• Placas de Petri: um conjunto de 5 placas de petri com tampa foram embaladas com jornal semelhante a um embrulho de presente. Contendo em torno de 10 porções cortadas de jornal, os materiais foram colocados um em cima do outro e cobertos pelo jornal comum. Após fechados, amarrou-se uma corda de barbante em volta para vedá-los;

• Erlenmeyer: nessa vidraria, foi utilizada uma rolha feita de algodão hidrofóbico (que não molha) e gaze. Essa rolha permite que o vapor entre dentro do frasco e esterilize a solução. Caso o recipiente esteja totalmente fechado, não haverá esterilização do material, pois o ar estéril não será capaz de adentrar à vidraria e matar qualquer microrganismo ali presente. A rolha de algodão, então, foi colocada na abertura do recipiente de forma a produzir um som relativamente alto quando retirada rapidamente. 

   Todos os recipientes utilizados foram devidamente identificados com a data da realização do procedimento, a turma que realizou o preparo do material e a identificação da respectiva vidraria. Além disso, foi colocado um adesivo que, ao final do processo de autoclavagem, surgisse uma listra inclinada indicando que aquele recipiente foi esterilizado na autoclave. A esterilização por calor úmido, por sua vez, é mais eficaz para destruir diversos microrganismos. Esse método ocasiona na desnaturação (perda na conformação tridimensional de uma proteína e, consequentemente, da função biológica) e coagulação de enzimas fundamentais para os processos metabólicos das bactérias.

III. Trabalho na zona de segurança

    Na prática de trabalho na zona de segurança, aprendemos a manusear os equipamentos do laboratório e trabalhamos diante da zona de segurança. A zona de segurança consiste  em uma região de aproximadamente 10 cm de raio em torno do bico de bunsen, onde o ar aquecido tende a formar uma corrente de convecção, evitando que microrganismos que estejam em suspensão no ar penetrem e contaminem esta área e, consequentemente, o material a ser utilizado. Resume-se em um método muito utilizado nos laboratórios de Microbiologia e tem o objetivo de manter o meio gasoso próximo dela estéril. É necessário que trabalhemos em meio estéril a fim de obter um melhor resultado em nossos processos, visto que o meio gasoso traz agentes que podem atrapalhar processos, como edificação de meio de cultura, análise de bactérias etc. Além disso, o meio gasoso mantém a esterilidade dos equipamentos já esterilizados, como pipeta, tubos de ensaio, entre outros. Esse é um método rápido, fácil e bem econômico, visto que o único gasto é de gás, proporcionando agilidade e facilidade no trabalho. 
    Embora seja um método de esterilização eficaz para manusear materiais que não podem entrar em contato com o meio externo, manusear próximo ao fogo acarreta em cuidados especiais que devem ser adotados. Deve-se manter os olhos bem atentos para que braço, dedos e mãos não toquem na chama, é necessários também ter cuidado com o cabelo, para que, curtos ou longos, não encostem na chama. Vale notar que esses cuidados e toda a prática devem ser acompanhados e ministrados por um profissional que tenha conhecimento do método e experiência de trabalho. A Microbiologia trabalha com muitos microrganismos e sua percepção a olho nu é quase que impossível, logo para ter-se qualidade no desenvolvimento do trabalho e dos resultados das práticas, o trabalho da zona de segurança vem como método rápido, prático e de muita utilidade para estudantes, pesquisadores e professores da área.

Manuseio dentro da zona de segurança.

Os procedimentos utilizados para manuseio na zona de segurança fora os seguintes:

• Flambagem da alça bacteriológica: antes de iniciar qualquer ação e após o manuseio em contato com microrganismos, no que diz respeito a seguir o roteiro de prática, colocou-se a alça na chama do bico de bunsen para aquecer ao rubro, isto é, até incandescer o metal do instrumento. Após a retirada da chama, a alça foi colocada na porção da placa de petri onde não há meio sólido, para que possa esfriar;

• Retirar a tampa do tubo: fez-se a retirada da tampa do tubo contendo microrganismo em meio líquido. Com a tampa posicionada no mindinho da mão direita, introduziu-se a alça até 1/4 do líquido contendo o material biológico. Após esse procedimento, a extremidade aberta do tubo foi flambado para evitar possíveis contaminações;

• Abrir a tampa da placa de petri: com a finalização do procedimento anterior, utilizando a mão para segurar a base da vidraria, o indicador e o dedão da mão esquerda, abriu-se a tampa da placa para introduzir a alça contendo a porção da bactéria. Passou-se a ponta dela no meio sólido cuidadosamente algumas vezes e fechou-se a tampa da placa de petri. Após isso, flambou-se a alça bacteriológica para matar qualquer resquício da amostra biológica restante no material. 

Manipulação dentro da zona de segurança.

IV. Método de coloração de Gram

     As diversas técnicas de coloração empregadas na Micrologia possuem como principal intuito a observação de estruturas morfológicas para a compreensão sucinta de uma determinada classe de microrganismos, tendo a capacidade de diferenciá-los. A técnica de coloração de Gram resume-se em um método no qual permite identificar grupos bacterianos debruçando-se na ultraestrutura da parede celular desses microrganismos. É uma técnica de coloração diferencial que utiliza mais de dois corantes para o procedimento, fornecendo a possibilidade de distinção de duas bactérias por meio da coloração de suas respectivas parede celular. As bactérias utilizadas para o experimento foram a Bacillus cereus, Staphylococus, Bacillus megaterium (grupo 2) e Hafui alveni.
       

Técnica de coloração simples com apenas 1 corante.

     O princípio básico dessa prática consiste em identificar a classe de alguma dessas bactérias mencionadas através de suas características diferenciais. Tais características referem-se à a estrutura da parede celular e a composição química dela. Os microrganismos que contêm elevados teores de ácido teicóico (peptideoglicano) em sua parede celular coram-se, utilizando a coloração de Gram, em roxo-azulado intenso, isto é, serão classificadas em Gram positivas. Em contrapartida, aqueles que possuem lipopossacarídeos na membrana externa somente se coram com o contra corante, mostrando-se em vermelho intenso, e são denominados Gram negativos.

Reagentes básicos utilizados:

• Cristal violeta;                
• Lugol;
• Álcool;
• Safranina;
• Água destilada.

Parede celular de bactérias gram negativas e positivas respectivamente.

      A prática foi realizada da seguinte forma: Transferiu-se as bactérias para a lâmina, secou no ar, fixou na chama do bico de bunsen, cobriu com Cristal violeta por 1 minuto, lavou com água destilada, cobriu-se com lugou por 1 minuto, lavou com água, cobriu com álcool 100% por 20 segundos, lavou com H20 destilada e secou delicadamente. Os resultados ainda não foram vistos no microscópio. 

Etapas da coloração de Gram.

V. Método de esgotamento

     Nessa prática, o objetivo era obter colônias puras de bactérias. Para separar e isolar os microrganismos, utilizou-se a técnica de esgotamento através da separação da placa de petri em quadrantes. Com o auxílio de uma alça bacteriológica, as bactérias foram coletadas do tubo contendo ágar liquido e depositadas em um quadrante da placa contendo meio de cultura. O preenchimento do segundo quadrante foi feito conduzindo as bactérias do primeiro quadrante até essa outra região. De modo semelhante, os microrganismos foram levados ao terceiro quadrante a partir do segundo.

       A fim de evitar contaminações, essas atividades foram realizadas dentro da zona de segurança fornecida pelo bico de bunsen. Além disso, a alça bacteriológica foi flambada antes de cada utilização para possibilitar a redução da concentração de bactérias no material, permitindo maior chance de obter culturas isoladas. Os resultados ainda não foram analisados, mas espera-se obter uma placa contendo colônias isoladas e o meio de cultura intacto.

VI. Bibliografia

http://www.pontociencia.org.br/experimentos/visualizar/como-funciona-uma-autoclave/343 acessado dia 13/10

http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/tecnicasdesemeadura.htm acessado dia 13/10


paginapessoal.utfpr.edu.br/geraldo/microbiologia-pratica/aulaspraticasmicro.../file acessado dia 13/10