Estudo do metabolismo do ferro em Angiostrongylus costaricensis (Nematoda: Metastrongylidae)

Ivelyne Nascimento Correia¹, Kyane Guerra Roque de Araújo¹, Thatiane Cristina Barros², Ester Maria Mota²

1- Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro; 2- Laboratório de Patologia – IOC/FIOCRUZ - RJ

           Introdução

        O Angiostrongylus costaricensis é um nematoide parasita que pertence à família Metastrongylidae e habita os ramos da artéria mesentérica da região ileocecal de roedores. Apesar de, inicialmente, ter maior incidência na Costa Rica, atualmente o A. costaricensis está amplamente distribuído nas Américas, onde no Brasil a maioria dos casos ocorre nos estados do Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo.

      Os hospedeiros naturais do A. costaricensis são moluscos terrestres e de água doce, onde os principais são o vetronicelídeo (conhecido como lesma) e Biomphalaria glabrata, e roedores, sendo o Sigmodon hispidus (Rodentia: Cricetidae) o mais importante. No ciclo biológico do parasita, os moluscos são hospedeiros intermediários e os roedores são hospedeiros definitivos.

      No interior das artérias de roedores, a fêmea adulta do A. costaricensis faz a ovipostura no ramo superior da artéria mesentérica do roedor. Os ovos, levados pela corrente sanguínea até a parede intestinal, eclodem, tornando-se larvas de primeiro estáidio ou L1. Estas larvas atravessam a parede intestinal e são eliminadas junto com as fezes.

      As larvas contidas nas fezes infectam os moluscos por via percutânea ou oral. Após a infecção, as larvas se alimentam,  crescem, passando por duas mudas: estádio L2 e, posteriormente, L3. Estas podem eventualmente ser eliminadas junto com a mucosidade dos moluscos.

      Folhas contaminadas pela mucosidade do moluscos ou a ingestão dos próprios moluscos são as formas de infecções nos roedores. No estômago do roedor, por ação do suco gástrico, as L3 perdem a parte superficial de seu revestimento e tornam-se mais ativas. A penetração pode ocorrer a partir da mucosa gástrica, mas preferencialmente do duodeno. A maioria das L3 invade linfáticos da mucosa intestinal e alcança a circulação sistêmica, onde desenvolve-se em vermes adultos. Poucas L3 podem, após a penetração intestinal, invadir capilares venosos e amadurecerem em vasos venosos intra-hepáticos.

      Assim como os roedores, humanos tornam-se infectados quando ingerem frutas e verduras contaminadas com L3. Porém, em humanos a taxa de eclosão dos ovos diminui consideravelmente. A larvogênese é eventual. Por esta última característica, os humanos são considerados hospedeiros acidentais.

      A não eliminação de L1 nas fezes de humanos dificulta o diagnóstico. O acúmulo dos ovos na parede intestinal leva a um processo inflamatório agudo intestinal, que aumenta a espessura da parede intestinal. Este processo pode ser detectado como uma massa palpável na fossa ilíaca direita. Por isso, os pacientes sentem dores abdominais e febre. Este quadro é acompanhado do aumento de leucócitos (principalmente eosinófilos). A doença causada pelo A. costaricensis em humanos é denominada Angiostrongilose abdominal.

      Muitas vezes, a presença da massa dolorosa palpável associada à falta de conhecimento da doença, leva a um diagnóstico inicial de tumor ou apendicite aguda. Nesses casos, o médico só descobre a real causa da doença após a cirurgia, no exame histopatológico do material ressecado.

      Não há tratamento específico para a angiostrongilíase abdominal. Anti-helmínticos convencionais agravam o caso, visto que causam a migração errática dos vermes para outros órgãos e podem desencadear tromboses. Apenas casos agudos são levados à cirurgia, enquanto casos pouco sintomáticos precisam ser avaliados singularmente pelo médico.

      Pouco se conhece sobre o metabolismo do A. costaricensis. Em lesões intestinais causadas pelo parasitismo deste metastrongilídeo, observou-se a presença de composto férrico fagocitado por macrófagos do infiltrado inflamatório.

      O ferro é essencial devido à sua presença em proteínas envolvidas em processos metabólicos fundamentais, como a síntese de DNA, respiração mitocondrial e transporte de oxigênio. Sendo o A. costaricensis um verme intravascular, tem o sangue como fonte alimentar. O mapeamento do conteúdo férrico em vermes adultos constitui o primeiro passo na investigação do papel deste elemento no metabolismo deste helminto.

             Objetivo

      O objetivo deste trabalho consiste em investigar o papel do ferro na fase adulta do A. costaricensis, identificando a localização deste elemento em cortes histológicos.

              Metodologia

            Ressecou-se a artéria mesentérica superior de um Sigmodon hispidus para retirar larvas de A. costaricensis. Este processo teve início na sedação do Sigmodon hispidus, que se seguiu da abertura abdominal do animal com uma tesoura e, posteriormente, da retirada das larvas com o auxílio de uma pinça.

            As larvas coletadas foram colocadas em uma placa de Petri, onde foram separadas em machos e fêmeas. Posteriormente, com o auxílio de uma lupa, observou-se as estruturas das larvas para verificar se a separação feita anteriormente encontrava-se correta.

            Depois, as larvas foram transferidas para dois frascos de vidro (o primeiro somente com machos e o segundo contendo apenas fêmeas) visando manter-se a distinção feita. Adicionou-se Milloning aos frascos para iniciar o processamento histológico.

            Assim, após o período destinado à fixação do material, trocou-se o Milloning por banhos de álcool, com o auxílio de uma pipeta de Pauster. O primeiro banho foi realizado com álcool 70%, que após 30 minutos, foi trocado por um álcool de concentração 80%, também deixado por 30 minutos. Desse modo, trocou-se os álcoois por concentrações maiores (85%, 90%, 95%), gradativamente, até chegar aos álcoois absolutos I, II e III, onde todos os banhos duraram 30 minutos.

            Posteriormente, os álcoois foram trocados por banhos de butanol, também em concentrações crescentes, durante minutos. Em seguida, foram realizados banhos de xilol para permitir a impregnação. Nesta, os frascos foram preenchidos com parafina, de modo que todos os vermes estivessem cobertos, e foram deixados na estufa a 60ºC.

            A etapa posterior foi a inclusão, onde os vermes foram transferidas para uma forma de inclusão, que foi preenchida com parafina líquida e tampada com um cassete. Esta forma foi colocada sobre uma placa fria para que endurecesse e formasse o bloco.

            Após a formação do bloco, este foi cortado por um micrótomo em tiras de 5µm. Para isso, utilizou-se um cubo de gelo para resfriar o bloco, quando este começava a apresentar temperatura ambiente. Em seguida, os cortes feitos foram transferidos por uma pinça para uma vasilha com água em temperatura ambiente, onde foram pescados com lâminas albuminizadas e devidamente identificadas por um marcador de vidro. A lâmina com o corte aderido em sua superfície passou ainda por um banho maria e/ou por uma placa quente. Isso para que o corte ficasse reto e sem dobras. Após todos os cortes desejados serem feitos, as lâminas que os continham ficaram novamente em uma estufa a 60ºC, para aguardar a coloração.

            Duas colorações foram realizadas neste projeto: Hematoxilina e Eosina (HE) e Azul da Prússia ou Coloração de Perls. A segunda visava indicar a presença de ferro no organismo do verme, por meio da cor azul.

            Para realizar ambas as colorações, colocou-se as lâminas em cubetas de vidro, que foram preenchidas por xilol I, II e III, onde cada um permaneceu por 3 minutos. Cada xilol foi devolvido ao frasco de origem por um funil e visavam desparafinar o corte.

            Em seguida, preencheu-se a cubeta com álcool, que assim como o xilol, permaneceu por 3 minutos e foi trocado por álcoois com concentrações crescentes. Estes também foram devolvidos para os frascos de origem por um funil e visavam hidratar os cortes.

            Posteriormente, adicionou-se água destilada por 3 minutos para finalizar a hidratação. Assim, permitiu-se que os cortes fossem corados pelos corantes mencionados.

            Primeiramente realizou-se a coloração de Hematoxilina e Eosina, onde após a etapa acima, preencheu-se a cubeta com Hematoxilina de Mayer por 20 minutos. Em seguida, lavou-se as lâminas dentro da cubeta em água corrente por 25 minutos, para retirar o excesso de corante. Depois, iniciou-se a desidratação pelo álcool 70% durante 3 minutos, que foram sucedidos pela adição de Eosina-Floxina por 30 segundos, pois esta encontrava-se nova.

            Em seguida, lavou-se rapidamente a cubeta com álcool 95% e desidratou-se com 3 banhos de álcool absoluto por 3 minutos cada. Estes foram sucedidos por banhos de 3 minutos de xilol para fazer a clarificação. Por fim, montou-se a lâmina adicionando goma de Damar na mesma e colocou-se uma lâmina, adequada ao tamanho do corte, sobre a goma, de modo a não formar bolhas de ar.

            Após a coloração de HE, realizou a coloração de Perls com as demais lâminas. Para isso, após o fim da hidratação, adicionou-se a solução estoque de Ferrocianeto 5% à cubeta com as lâminas, deixando a mesma por 5 minutos. Em seguida, trocou-se a solução estoque pela solução de uso (feita no momento de adição, onde há 30 ml de ácido clorídrico e 70 ml de Ferrocianeto 5%), que ficou na cubeta por 20 minutos. Esta foi descartada corretamente após o uso.

            Posteriormente, lavou-se as lâminas 2 vezes com água destilada, por 3 minutos cada. Depois, adicionou-se o vermelho rápido nuclear por 5 minutos e devolveu-se a solução para o frasco de origem. Em seguida, lavou-se em água destilada e fez-se as etapas de desidratação, clarificação e montagem da lâmina de modo análogo ao descrito anteriormente para a coloração de HE.       

               

Observação: Todos os procedimentos foram realizados com os EPIs necessários.

       Resultados

            A coloração feita por Hematoxilina e Eosina apresentou bolhas de ar após a montagem da lâmina, por isso não foi possível capturar sua imagem. No entanto, as imagens capturadas das lâminas coradas por Perls encontram-se a seguir.

Figura 1: Nos helmintos machos, a presença de compostos férricos, evidenciada pela coloração de  Pearls, foi positiva ao longo do intestino.

Figura 2: Na extremidade final dos helmintos machos, a presença de compostos férricos, evidenciada pela coloração de Pearls, foi negativa na região da bolsa e espículos.

 Discussão e Conclusão

      Neste trabalho, ainda em fase preliminar, evidenciou-se a presença de composto férrico, oriundo da ingestão de hemoglobina, no intestino de machos adultos de A. costaricensis. Outras regiões do corpo foram negativas à coloração de Perls. Em Schistosoma mansoni, o intestino é a região de digestão da hemoglobina e cristalização do heme em hemozoína, o qual é regurgitado para a circulação. Ainda é desconhecida a natureza de transportadores de ferro nas células intestinais do A. costaricensis. Imunomarcação para ferritina, ferroportina e receptor de transferrina em cortes congelados de A. costaricensis estão programadas neste estudo e poderão dar pistas sobre o metabolismo do ferro neste modelo. O material ainda está em processamento. Novas amostras de helmintos estão sendo coletadas para coloração de cortes histológicos, cortes congelados e helmintos inteiros.