Relatório referente à prática de "Testes Bioquímicos" (Grupo 4)

Integrantes do grupo 4: Gustavo Nogueira, João Pedro, Livia Ferreira, Luana Alves e Matheus Machado. 

1.    INTRODUÇÃO

  

Os testes bioquímicos possuem uma enorme frequência de utilização quando se visa à identificação e distinção de microrganismos, tais como bactérias e leveduras, tendo como base reações bioquímicas, como a possibilidade da degradação de compostos bioquímicos (tais como aminoácidos, enzimas, carboidratos, etc). Esses testes são amplamente utilizados, sendo obtidas respostas colorimétricas que auxiliam no diagnóstico.

Para que ocorra uma precisa análise, segue-se uma ordem: na maioria dos casos, os testes são expressos como positivo ou negativo, o que é facilitado pela presença de agentes que tornam a reação colorimétrica. Depois, tem-se um conjunto de resultados agrupados, nos quais a identificação bacteriana acontece de acordo com suas características pré-estabelecidas. 
Durante as observações, por exemplo, uma das formas de se observar as diferenças entre os resultados dos testes positivos e negativos é a partir da identificação de uma mudança física no meio, como a produção de determinado precipitado. Entretanto, isso não ocorre em todos os testes bioquímicos.

A fim de se obter diferentes respostas das bactérias, os testes bioquímicos são efetuados em diferentes meios, cada qual com sua função.

2.    OBJETIVOS

Os objetivos da atividade prática em questão eram a compreensão dos testes bioquímicos empregados e da sua importância para a diferenciação de determinados parâmetros envolvendo a bactéria Salmonela spp., tais como motilidade, tipo de metabolismo (oxidativo ou fermentativo), presença da enzima urease, presença da proteína citrato-permease, produção de H₂S, atuação da enzima triptofanase, descarboxilação do aminoácido lisina e capacidade de conversão da glicose em acetilmetilcarbonil ou acetoína.

3.    MATERIAIS

• Caldo ureia;
• Ágar oxidação-fermentação glicose (com e sem óleo);
• Ágar oxidação-fermentação lactose (com e sem óleo);
• Ágar lisina ferro (meio LIA);
• Dois meios vermelho de metila (caldo MRVP/VM);
• Meio SIM;
• Ágar Citrato Simmons;
• Meio TSI (Ágar triple sugar iron)
• Agulha bacteriológica;
• Tubos de ensaio;
• Indicador vermelho de metila;
• Indicador α-naftol;
• Conta gotas;
• Bactéria Salmonela spp.;
• Alça bacteriológica;
• Reativo de Kovacs;
• Álcool absoluto.

4.    MÉTODOS

Para todos os procedimentos realizados, as práticas assépticas foram empregadas. Sendo assim, sempre que um tubo de ensaio era aberto ou fechado, sua borda superior era flambada em bico de Bunsen.

Além disso, todos os métodos ocorreram sob a zona de assepsia, considerando o raio de proteção fornecido pela chama do bico de Bunsen.

4.1    Teste para verificação da hidrólise da ureia

Tendo sido aquecida ao rubro em bico de Bunsen e esfriada à temperatura ambiente, uma alça bacteriológica foi introduzida em um tubo de ensaio contendo a bactéria Salmonella spp.

Depois, tal bactéria foi inoculada, com o auxílio da alça bacteriolófica, em um tubo de ensaio estéril que continha caldo ureia.

4.2    Teste da utilização do citrato

De modo inicial, foi flambada uma alça bacteriológica ao rubro, a qual foi, posteriormente, esfriada à temperatura ambiente. Após essa etapa concluída, esta foi inserida em um tubo de ensaio contendo Salmonella spp.

Em sequência, tal alça foi introduzida no ágar citrato de Simmons contido em um tubo de ensaio estéril. Foram realizadas estriações no meio, de modo que a bactéria fosse inoculada.

4.3    Teste da redução do sulfeto, produção de indol e motilidade

Após ser aquecida ao rubro em bico de Bunsen, e resfriada, uma agulha bacteriológica foi inserida em um tubo de ensaio que continha a bactéria Salmonella spp. Posteriormente, esta foi introduzida verticalmente no centro de um tubo de ensaio estéril contendo meio SIM, de modo que fosse inocula a bactéria no meio em questão.

Após incubação, dosou-se, em outra aula prática, com o auxílio de um conta gotas, o reativo de Kovacs no tubo.

4.4    Testes da oxidação e da fermentação

Uma agulha bacteriológica foi aquecida ao rubro e esfriada à temperatura ambiente para, posteriormente, ser introduzida em um tubo de ensaio contendo a bactéria Salmonella spp.

Posteriormente, foi inserida verticalmente no centro de um tubo de ensaio estéril contendo o meio oxidação-fermentação que apresentava glicose e óleo.

Esse mesmo procedimento foi realizado para os tubos de ensaio que continham o meio oxidação fermentação com glicose sem óleo, com lactose e óleo e com lactose sem óleo.

4.5    Teste da descarboxilação da lisina

Após uma agulha bacteriológica ter sido aquecida ao rubro, em bico de Bunsen, e resfriada, esta foi inserida em um tubo de ensaio contendo Salmonella spp.

Em seguida, tal agulha foi introduzida no centro da base de um tubo de ensaio estéril contendo meio LIA, tendo sido realizadas, posteriormente, estrias na rampa de tal meio.

4.6    Testes para verificação da conversão da glicose em acetilmetilcarbonil ou em acetoína

Inicialmente, aqueceu-se ao rubro, em bico de Bunsen, uma agulha bacteriológica e, posteriormente, ela foi esfriada à temperatura ambiente. Em seguida, esta foi inserida em um tubo de ensaio contendo a bactéria Salmonella spp. e, posteriormente, tal alça foi introduzida no tubo de ensaio estéril contendo o meio vermelho de metila. O mesmo procedimento foi realizado para um segundo meio vermelho de metila.

Após incubação, em outra aula prática pingou-se, com o auxílio de um conta gotas, α-naftol em um dos tubos contendo o meio vermelho de metila. Já no outro tubo, adicionou-se o indicador vermelho de metila.

4.7    Teste do meio TSI

Inicialmente, flambou-se uma agulha bacteriológica ao rubro, em bico de Bunsen. Esta foi esfriada à temperatura ambiente. Após essa etapa concluída, a agulha foi inserida em um tubo de ensaio contendo Salmonella spp.

Em seguida, a agulha contendo a bactéria foi introduzida no centro da base de um tubo de ensaio estéril contendo meio TSI. Posteriormente, foram realizadas estrias na rampa do meio.

5.    FUNDAMENTAÇÕES TEÓRICAS DOS TESTES BIOQUÍMICOS REALIZADOS

5.1    Teste para verificação da hidrólise da ureia

Este teste objetiva detectar a hidrólise da ureia pela enzima urease. Comumente, ele é realizado para diferenciar as bactérias do gênero Proteus spp. em relação a outras enterobactérias, como Salmonela spp. As bactérias do gênero Salmonela spp. caracterizam-se como urease negativas, enquanto as do gênero Proteus spp. são urease positivas.

O meio utilizado para a realização desse teste denomina-se caldo ureia. Ele apresenta em sua composição, além da ureia, o indicador vermelho de fenol, cuja coloração é alterada de rosa claro para rosa escuro (podendo tender ao vermelho) em pH maior do que 8,4. Tal indicador é eficiente, neste caso, porque a hidrólise da ureia resulta em produção de amônia, a qual torna o pH maior do que 8,4. Assim, infere-se que a cor observada é rosa escuro para resultados positivos (em relação à hidrólise da ureia pela ação da urease).

5.2    Teste da utilização do citrato

O teste bioquímico em questão possui como finalidade determinar a presença ou a ausência da proteína de membrana citrato-permease. Quando tal proteína está presente na membrana plasmática das bactérias, estas são capazes de transportar o ânion citrato para o meio intracelular (citosol), onde ocorrerá a utilização de tal espécie como fonte de carbono.

O meio utilizado durante o teste em questão é denominado ágar citrato de Simmons, o qual apresenta o indicador azul de bromotimol, o qual aponta a coloração verde em pH 6,9, amarelo em pH menor do que 6,9 e azul em pH maior do que 7,6. A presença do azul de bromotimol permite que seja identificada a alcalinização do meio, a qual ocorre com a utilização do citrato como fonte de carbono, a partir da produção de radicais alcalinos. 

Depreende-se, portanto, que a coloração do meio é alterada para azul, caso haja a citrato-permease. Destaca-se, ainda, que a coloração do meio sem a inoculação de bactéria corresponde a verde, sendo tal cor também indicativa de resultado negativo para a presença de citrato-permease.

5.3    Teste da redução do sulfeto, produção de indol e motilidade

            Este teste foi realizado em um mesmo meio, denominado SIM, o qual contém sulfato ferroso ou “tiossulfato de sódio acrescido de ferro peptonizado”

            Em relação à detecção da redução do sulfeto, o objetivo é determinar se a bactéria produz sulfeto de hidrogênio (H₂S). Tal síntese ocorre a partir da reação do sulfeto de hidrogênio com o ferro ou o sulfato ferroso presente no meio. Esta tem como produto um precipitado negro. Portanto, caso seja observada a formação de um precipitado de coloração negra, o resultado será positivo para a produção de H₂S.

No que tange à produção de indol, esta ocorre a partir do aminoácido triptofano (fornecido no meio por peptonas), numa reação catalisada pela enzima triptofanase. Nessa reação, também é formado ácido pirúvico e amônia.

Após a adição do reativo de Kovacs (composto por álcool amílico, ácido clorídrico e p-dimetilaminobenzaldeído), caso se forme um anel vermelho na camada alcóolica (onde tal reativo foi adicionado), o resultado é positivo para a produção do indol (e, consequentemente, para a presença de triptofanase). Caso o anel seja amarelo, a bactéria não produz indol a partir do triptofano. As bactérias da família Enterobacteriaceae, como a E. coli são indol positivas.

Por fim, o teste referente à motilidade é verificado observando-se um crescimento difuso direcionado pela linha de inoculação. Tal observação é possível porque o meio em questão apresenta concentração pequena de ágar. Sendo assim, é caracterizado como semissólido, o que possibilita a mobilidade da bactéria apenas na linha de inoculação.

5.4    Teste da oxidação e da fermentação

O ágar oxidação-fermentação glicose (com e sem óleo) - também denominado meio OF. Tal meio apresenta, além de glicose, o indicador azul de bromotimol. Esse indicador é necessário para que se verifique se o meio foi acidificado ou não. Ele é utilizado para verificação se uma bactéria apresenta metabolismo fermentativo, oxidativo ou fermentativo-oxidativo

Considerando-se a via fermentativa (ocorrida em anaerobiose, ou seja, no meio que apresenta óleo, pois este impede o fornecimento de oxigênio ao meio), ocorre a conversão do piruvato (obtido por meio do metabolismo da glicose ou da lactose) em ácidos mistos. Assim, o meio é acidificado e a coloração apresentada pelo azul de bromotimol passa a ser amarelo. O resultado é, portanto, positivo para a fermentação ácido-mista.

Em relação à via oxidativa (ocorrida na condição de aerobiose, ou seja, no tubo sem óleo), o metabolismo de determinado carboidrato (lactose ou glicose) ocasiona também a formação de ácidos – embora mais fracos –, o que torna o meio ácido, ocasionando a apresentação de uma cor amarela pelo azul de bromotimol.

Portanto, uma mesma bactéria pode apresentar metabolismo oxidativo e fermentativo, ou apenas um destes.

5.5    Teste da descarboxilação da lisina

Este teste é utilizado para verificar se a bactéria é capaz de descarboxilar o aminoácido lisina.

Na descarboxilação, um grupo carboxílico é removido de um aminoácido, de modo que são gerados dióxido de carbono e amina. Tal reação ocorre apenas em meio ácido e, dessa forma.

No meio ágar lisina ferro, cuja coloração é amarela, há o indicador de pH denominado púrpura de bromocresol, que, em pH alcalino (o qual é atingido com os produtos da descarboxilação da lisina) assume a coloração púrpura. Logo, para a descarboxilação da lisina, o resultado é positivo quando a coloração do meio apresenta-se púrpura.

É interessante destacar que tal meio também apresenta óleo mineral, que garante a anaerobiose do meio, para que ocorra a fermentação da glicose e, assim, o meio seja acidificado. 

5.6    Teste para verificação da conversão da glicose em acetilmetilcarbonil (teste VM)

Este teste visa à identificação da capacidade da bactéria em converter a glicose em ácido, em vez de convertê-la em acetilmetilcarbonil. O meio em questão (vermelho de metila, ou caldo MRVM) apresenta glicose, peptona e tampão fosfato.

Ao adicionar o indicador vermelho de metila no meio em questão, caso a cor vermelho tijolo seja apontada, significará que o pH atingiu o valor igual ou inferior a 4,4. Nesse caso, o resultado é positivo para a fermentação ácido-mista (foram produzidos ácidos pela fermentação da glicose). Caso a coloração obtida seja amarela, depreende-se que o pH é maior do que 6,4 e o resultado é negativo para a fermentação ácido-mista. 
Ressalta-se que a fermentação ácido-mista ocasiona a formação de etanol, ácido acético, ácido succínico, ácido fórmico e ácido lático a partir do piruvato (este pode ser obtido a partir do metabolismo da glicose).

5.7    Teste para verificação da conversão da glicose em acetoína (teste VP)

Tal teste objetiva a verificação da capacidade do microrganismo de sintetizar acetoína a partir da glicose. Após incubação, caso a adição de hidróxido de potássio revele, após quinze minutos, a coloração vermelho tijolo, depreende-se que o resultado é positivo para a produção de acetoína.

5.8    Teste do meio TSI

O meio triple sugar iron (TSI) é composto pelo indicador vermelho de fenol, por glicose, lactose, sacarose, peptona, tiossulfato, cloreto de sódio, extrato de carne, extrato de levedura e sulfato ferroso. Sua utilização ocorre com o objetivo de identificar se determinada bactéria fermenta tais carboidratos e se reduz o sulfeto de hidrogênio a sulfito (quando ocorre a formação de um precipitado negro).

Dependendo dos resultados observados na inclinação do meio e em sua base, os diagnósticos são diferentes. Destaca-se que sua inclinação objetiva possibilitar o crescimento em anaerobiose na porção da base.

6.    RESULTADOS

6.1    Teste para verificação da hidrólise da ureia

Considerando-se a hidrólise da ureia, o resultado objetivo foi negativo para a Salmonella spp., posto que, após incubação, o tubo de ensaio apresentou coloração rosa-claro (Figura 1). Caso fosse positivo, a cor seria rosa pink.

Figura 1. Meio contendo Salmonella spp. e caldo ureia, após diagnóstico (negativo para hidrólise da ureia).

6.2    Teste da utilização do citrato

O tubo contendo Salmonella spp. e meio citrato de Simmons apresentou coloração azul após incubação (Figura 2), o que indica que o resultado foi positivo para a presença da proteína de membrana citrato-permease. Isso significa que a Salmonella spp. é capaz de transportar o citrato para o citosol e utilizá-lo como fonte de carbono.

Figura 2. Tubo de ensaio contendo meio citrato de Simmons e Salmonella spp. Resultado positivo para a presença da proteína de membrana citrato-permease.

6.3    Teste da redução do sulfeto, produção de indol e motilidade

A bactéria presente no primeiro tubo era a Escherichia coli, inoculada por outro grupo (Figura 3). No segundo tubo, havia Salmonella spp. (Figura 3).

Pode-se observar que o triptofano foi degradado após a adição de reativo de Kovacs ao tubo contendo E.coli, tendo sido obtido resultado positivo para a produção de indol (como indica o anel vermelho). Como não houve precipitado negro nesse tubo, conclui-se que não ocorreu a redução do sulfeto de hidrogênio. Ademais, por ter ocorrido a difusão da bactéria ao longo da linha de inoculação, infere-se que a bactéria em questão apresenta motilidade.
Em contrapartida, no tubo que continha Salmonella spp, ocorreu a redução do sulfeto de hidrogênio, mas o triptofano não foi degradado a indol (uma vez que o anel obtido apresentava a coloração amarela). Logo, a Salmonella spp. é indol negativo. No que tange à motilidade, obteve-se resultado positivo para tal bactéria, uma vez que foi observada difusão desta ao longo da linha de inoculação.

Figura 3. Tubo de ensaio contendo E.coli em meio SIM (inoculado pelo grupo 3), à esquerda e tubo de ensaio contendo Salmonella spp. em meio SIM, à direita.

6.4    Teste da oxidação e da fermentação

A Salmonella spp. apresentou diagnóstico positivo para o metabolismo fermentativo da glicose, posto que a coloração do tubo que continha glicose e óleo (condição, portanto, de anaerobiose) foi amarela após incubação. O resultado foi negativo para a fermentação da lactose (condição de anaerobiose). Tais resultados encontram-se na Figura 4.

O resultado foi também foi positivo para o metabolismo oxidativo da glicose, posto que o meio que continha tal carboidrato em aerobiose (sem óleo) exibiu coloração amarela, após incubação. Para o metabolismo oxidativo da lactose (em meio sem óleo), o resultado foi negativo, uma vez que a coloração do tubo não mudou para amarelo. Esses resultados também estão dispostos na Figura 4.

Figura 4. Meios oxidação-fermentação contendo glicose e lactose em presença e em ausência de óleo. Os tubos nos quais a coloração adquirida foi amarela indicam resultado positivo para determinado tipo de fermentação. A Salmonella spp. possui, portanto, metabolismo oxidativo e fermentativo da glicose. Clique na imagem para ampliá-la.

6.5    Teste da descarboxilação da lisina

Ao final da análise o tubo de ensaio deveria ter apresentado coloração púrpura, o que não ocorreu adequadamente. Portanto, o teste foi inconclusivo.

Figura 5. Meio ágar lisina ferro contendo Salmonela spp. O resultado foi inconclusivo.

6.6       Teste para verificação da conversão da glicose em acetilmetilcarbonil (teste VM)

 O tubo de ensaio contendo Salmonella spp. em meio vermelho de metila (caldo MRVM) apresentou coloração vermelho tijolo após a adição de α-naftol (Figura 6). O teste apresentou resultado positivo, portanto, para a fermentação ácido-mista (que ocorre em pH abaixo de 4,4). Logo, tal bactéria é capaz de converter a glicose em acetilmetilcarbonil.
Acrescenta-se que muitas bactérias da família Enterobacteriaceae, na qual está inclusa a Salmonela spp., realizam esse tipo de fermentação.

Figura 6. Meio vermelho de metila (caldo MRVP) contendo Salmonella spp. A coloração apresentada após adição do indicador vermelho de metila foi vermelho tijolo, indicando positividade para a conversão de glicose em acetilmetilcarbonil.

6.7    Teste para verificação da conversão da glicose em acetoína (teste VP)

A adição de hidróxido de potássio ao tubo contendo meio vermelho de metila (caldo MRVP) revelou, após quinze minutos, a coloração vermelho tijolo do meio.

Dessa forma, infere-se que o resultado para Salmonella spp. é positivo para a produção de acetoína (Figura 7).

Figura 7. Meio vermelho de metila (MRVP) contendo Salmonella spp. e hidróxido de potássio. Coloração vermelho tijolo após incubação a temperatura ambiente por quinze minutos, indicando resultado positivo para a conversão de glicose em acetoína.

6.8    Teste do meio TSI

Para a Salmonella spp., foi obtida a coloração vermelha na inclinação do meio TSI, bem como a formação de um precipitado negro na base (Figura 8). A coloração amarela na base, com a formação de bolhas, foi mascarada na

Tais resultados indicam que houve a fermentação apenas da glicose, em aerobiose, na rampa com a produção de H₂S (pois este foi gerado e reduzido a sulfito, precipitado negro) na base.

É importante destacar que a glicose, nesse meio, é o carboidrato em menor concentração. Assim, como a Salmonella spp. a utilizou em seu metabolismo oxidativo (anteriormente comprovado pelo teste oxidação-fermentação), houve a necessidade da utilização das peptonas presentes no meio. A utilização destas provoca a geração de espécies alcalinas e, por isso, o indicador vermelho de fenol indica a coloração vermelha (para valores de pH maiores do que 6,8, essa é a coloração visualizada).

Na base, foi observado o precipitado negro, após reação com os íons ferroso presentes no meio (com base no princípio explicado para a redução do sulfeto de hidrogênio, anteriormente). 

Figura 8. Meio TSI inoculado com Salmonella spp. Na base, sujeita a condição de anaerobiose, observou-se a formação de um precipitado preto (o que indica a produção do H₂S e a redução deste). Na rampa, a coloração vermelho foi observada, como consequência da alcalinização do meio pela utilização das peptonas, após toda a glicose ter sido utilizada no metabolismo oxidativo da Salmonella spp.

7.    BIBLIOGRAFIA

FRANCO, Robson Maia. Atlas de Microbiologia de Alimentos. Rio de Janeiro: Gráfica Editora Stamppa, 2012.